藍(lán)萼乙素對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

吳元肇，金 早

乳腺癌作為國內(nèi)外常見的女性惡性腫瘤，在40～60歲的人群中具有較高的發(fā)病率。目前，乳腺癌已成為威脅婦女生命健康的重大疾病，其發(fā)病率在女性腫瘤中躍居第一，病死率亦高達(dá)40%[1]。乳腺癌按生物學(xué)行為和臨床病理特征可分為不同亞型，其中較為嚴(yán)重的是三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC），占全部乳腺癌的15%～20%[2]。通過免疫組化可發(fā)現(xiàn)，TNBC組織中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（Her-2）均表達(dá)為陰性[3]。作為乳腺癌中較為特殊的亞型，TNBC具有高度侵襲性，極易發(fā)生局部及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[4]。由于TNBC缺乏明確靶點(diǎn)，臨床暫無有效的內(nèi)分泌治療及靶向治療策略，因而無法進(jìn)行系統(tǒng)治療[5]，因此探索TNBC新的治療藥物具有重要的意義。

中醫(yī)藥在乳腺癌治療方面具有悠久歷史，因其療效優(yōu)及不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤治療方面取得了明顯進(jìn)展[6]。藍(lán)萼香茶菜（Rabdosia japonica (Burm. f.) Hara var. glaucocalyx (Maxim.)Hara）味苦、寒，具有清熱利尿、解毒消腫等功能，臨床常用于感冒、咽喉腫痛、胃炎、肝炎、乳腺炎、癌癥等治療[7-8]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)萼香茶菜中的重要二萜類成分，可有效干擾乳腺癌病變進(jìn)程[9]，同時(shí)其主要二萜類成分-藍(lán)萼乙素，體外可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲[10]。因此筆者推測(cè)藍(lán)萼乙素可通過抑制乳腺癌細(xì)胞遷移與侵襲，從而發(fā)揮治療乳腺癌的作用?；谏鲜觯菊n題擬體外培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，通過分子生物學(xué)手段探討藍(lán)萼乙素的抗癌機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人乳腺癌細(xì)胞株（MDAMB-231）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；MTT、DMSO購自美國Sigma Aldrich公司；藍(lán)萼乙素（L-083-180611）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；BCA、ECL試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、p-P38MAPK、P38MAPK及叉頭蛋白O3A（FOXO3α）抗體購自美國Cell signaling Technology公司；β-Tubulin、二抗購自南京巴傲得生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；ORMA371型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；Western blotting轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Gel Doc凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；Synergy HT酶標(biāo)儀購自美國BioTeK公司；Olympus AX70顯微照相系統(tǒng)購自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞傳代與培養(yǎng) 取人MDA-MB-231細(xì)胞，將其接種在RPMI1640（10% FBS+1% P/S）中，稀釋后重懸，在37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，重懸為1×105個(gè)/ml密度，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積為100 μL，置于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)加入不同濃度（0、2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。23 h后加入MTT液（5 g/L）20 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出96孔板并棄上清，每孔再加入150 μL DMSO振蕩10 min溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）。計(jì)算細(xì)胞增殖率（%）=（A處理組/A空白對(duì)照組）×100%。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，稀釋成1×106個(gè)/mL濃度后接種于6孔板中，置于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)用移液槍頭（200 μL）在孔底部中間劃條直線。PBS洗去脫落細(xì)胞，每孔中加入不同濃度（0、2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)，采用倒置顯微鏡觀察、拍攝劃痕0 h及24 h的細(xì)胞遷移情況，并計(jì)算細(xì)胞的遷移距離。

1.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力 采用Matrigel（1:8稀釋）對(duì)Transwell小室底部膜的上室面進(jìn)行鋪膠，隨后置于細(xì)胞孵育箱中使Matrigel聚合成凝膠。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，將其稀釋成1×106個(gè)/mL，取100 μL懸液加入上室，下室中加入600 μL培養(yǎng)基。將MDA-MB-231置于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)加入不同濃度（0、2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素進(jìn)行干預(yù)。24 h后取出小室，棄上清液，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，顯微鏡下任意抽取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞侵襲率（%）=（處理組細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 免疫印跡（Western blotting） 法檢測(cè)N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、p-P38MAPK、P38MAPK、FOXO3α及β-Tubulin表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，按1×106個(gè)/ml接種于6孔板，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)加入不同濃度（0、2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素進(jìn)行干預(yù)。24 h后收集細(xì)胞并裂解，取20 μg蛋白，經(jīng)SDSPAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA封閉。N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、p-P38MAPK、P38MAPK、FOXO3α及β-Tubulin一抗4 ℃過夜孵育，再用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，以β-Tubulin為內(nèi)參。ECL化學(xué)發(fā)光、顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)萼乙素可有效抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力 空白對(duì)照組（0 μmol/L）中乳腺癌細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞活力較強(qiáng)。加入不同濃度（2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素可明顯抑制細(xì)胞增殖，與空白對(duì)照組比較有明顯差異（P＜0.05），且呈濃度依賴性，以4、8 μmol/L藍(lán)萼乙素的作用較強(qiáng)。見圖1。

圖1 藍(lán)萼乙素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

2.2 藍(lán)萼乙素可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲能力 Transwell檢測(cè)結(jié)果表明，空白對(duì)照組中MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力較強(qiáng)。加入不同濃度的（2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素進(jìn)行處理，具有侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞明顯減少，與空白對(duì)照組比較差異明顯（P＜0.05），且呈濃度依賴性，以4、8 μmol/L藍(lán)萼乙素的作用較強(qiáng)。見圖2。

圖2 藍(lán)萼乙素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 藍(lán)萼乙素可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組中MDAMB-231細(xì)胞的傷口愈合較快。加入不同濃度的藍(lán)萼乙素（2、4、8 μmol/L）干預(yù)后，可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移速度，與空白對(duì)照組比較差異明顯（P＜0.05），以8 μmol/L藍(lán)萼乙素的作用最強(qiáng)。見圖3。

圖3 藍(lán)萼乙素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

圖4 藍(lán)萼乙素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中p-p38MAPK及FOXO3a表達(dá)水平的影響

2.4 藍(lán)萼乙素可明顯提高乳腺癌細(xì)胞中p-P38MAPK及FOXO3a的表達(dá)水平 Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，MDA-MB-231細(xì)胞中p-P38MAPK及FOXO3a的表達(dá)水平較低。加入不同濃度（2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素干預(yù)處理后，乳腺癌細(xì)胞中的p-P38MAPK及FOXO3a表達(dá)水平明顯增加，與空白對(duì)照組比較差異明顯（P＜0.05），且呈濃度依賴性，以4、8 μmol/L藍(lán)萼乙素的作用較強(qiáng)。見圖4。2.5 藍(lán)萼乙素干擾乳腺癌細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)水平 Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)水平較低，而Vimentin及N-cadherin的表達(dá)水平較高。加入不同濃度（2、4、8 μmol/L）藍(lán)萼乙素可明顯促進(jìn)E-cadherin的蛋白表達(dá)，抑制Vimentin及N-cadherin的蛋白表達(dá)，與空白對(duì)照組比較差異明顯（P＜0.05），且呈濃度依賴性，以4、8 μmol/L藍(lán)萼乙素的作用較強(qiáng)。見圖5。

圖5 藍(lán)萼乙素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin及N-cadherin表達(dá)的影響

3 討論

近年來，隨著發(fā)病率及死亡率的不斷攀升，癌癥已成為中國疾病死亡的首要因素。乳腺癌是中國女性的常見癌癥，嚴(yán)重危害婦女健康，其發(fā)病例數(shù)、死亡例數(shù)分別占全球發(fā)病及死亡的11.2%及9.2%，且發(fā)病年齡呈年輕化，對(duì)社會(huì)、家庭造成嚴(yán)重影響[11]。通常該類腫瘤具有高侵襲性，可誘發(fā)多臟器功能衰竭與惡性病變，最終導(dǎo)致患者死亡。臨床常采用手術(shù)切除進(jìn)行治療，但術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移難以避免，因此尋找可有效抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的藥物是乳腺癌治療領(lǐng)域的焦點(diǎn)[12]。天然藥用植物長(zhǎng)期以來作為抗腫瘤藥開發(fā)的重要源頭，從中尋找生物活性產(chǎn)物則是藥物研發(fā)人員的關(guān)鍵目標(biāo)[13]。因此，本課題擬體外培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，并加入藍(lán)萼乙素干預(yù)處理，探討藍(lán)萼乙素治療乳腺癌的作用及機(jī)制。

EMT是上皮細(xì)胞獲得遷移能力的主要途徑，通過該方式使得上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性、基底膜連接受損等，從而可獲得高遷移、侵襲及降解細(xì)胞外基質(zhì)等能力，使腫瘤細(xì)胞向鄰近組織侵襲或進(jìn)入血管并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[14]。主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞間緊密連接的胞膜蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少，而間質(zhì)細(xì)胞間的連接蛋白（N-cadherin、Vimentin）表達(dá)增加[15-16]。已有研究表明，EMT在乳腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中起重要作用[17]，因此通過干預(yù)EMT的進(jìn)程可成為控制乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)萼乙素可有效抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin及Vimentin的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，縮短細(xì)胞的遷移距離，同時(shí)還可減少侵襲細(xì)胞數(shù)量。提示藍(lán)萼乙素可通過干擾EMT進(jìn)程有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移與侵襲能力。而p38MAPK作為MAPK家族中的重要成員，當(dāng)其活化后可介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)，從而參與細(xì)胞分化、遷移、調(diào)亡及增殖等[18]。同時(shí)，F(xiàn)OXO3a作為轉(zhuǎn)錄因子FOXO家族成員，具有抑癌作用，在人體各組織器官（如：肺、肝、乳腺等）中廣泛分布，參與細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及氧化應(yīng)激等重要生理活動(dòng)[19]。通過刺激p38MAPK磷酸化可有效促進(jìn)FOXO3a蛋白的表達(dá)[20]。方瑞等[21]發(fā)現(xiàn)，通過激活p38MAPK/FOXO3a信號(hào)通路可有效干擾三陰性乳腺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，繼而干擾相關(guān)遷移與侵襲的行為活動(dòng)，與與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，藍(lán)萼乙素能促進(jìn)p38MAPK的磷酸化及FOXO3a的蛋白表達(dá)，同時(shí)還可有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力。

綜上所述，藍(lán)萼乙素可通過介導(dǎo)p38MAPK/FOXO3a信號(hào)通路，調(diào)控MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的能力。