落羽杉葉片和球果揮發(fā)油化學(xué)成分及其抗細(xì)菌活性①

向生權(quán) 唐祥佑 彭遠(yuǎn)航 鄒坤林1, 張君君 王 軍

（1 高要嘉耀林業(yè)發(fā)展有限公司 廣東肇慶526100；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東廣州510642；3 廣州沛森園林景觀設(shè)計(jì)有限公司 廣東廣州510520）

落羽杉［Taxodium distichum（L.） Rich.］，又名落羽松，是杉科落羽杉屬植物，原產(chǎn)于美國(guó)東南部、非洲南部、歐洲和亞洲東部，是古老的孑遺植物。落羽杉具有樹干筆直優(yōu)美、生長(zhǎng)速度快、木材優(yōu)良、病蟲害少、耐水耐腐蝕及適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在美國(guó)被稱為“永不腐朽之木”［1-2］。落羽杉具有較好的水淹耐受性，是我國(guó)南方地區(qū)農(nóng)田林網(wǎng)建設(shè)和造林的重要樹種［3］。目前，對(duì)落羽杉的研究主要集中在良種選育、生理生化［4-5］、園林綠化［6-7］及水位變化［8-10］等對(duì)落羽杉的影響，對(duì)落羽杉葉片和果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)組成及其抗細(xì)菌活性的研究尚未見報(bào)道。

植物揮發(fā)油，又稱為植物精油，是指從植物中提取具有揮發(fā)性的油狀液體，主要由萜類、芳香族、脂肪族及含氮或含硫化合物組成，是植物重要的次生代謝產(chǎn)物。植物揮發(fā)油大多為無色或淡黃色，難溶于水，易溶于無水乙醚、正己烷和氯仿等有機(jī)溶劑［11］。植物精油因其低毒、高效和易分解等特點(diǎn)，可作為天然殺菌劑、殺蟲劑和抗氧化劑，因此，人們?cè)絹碓街匾晫?duì)其植物精油的研究［12-13］。本研究以落羽杉為研究對(duì)象，通過提取落羽杉葉片和球果中的揮發(fā)油，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其化學(xué)組成和相對(duì)百分含量，采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性，從而為落羽杉資源的合理開發(fā)和利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

落羽杉的葉片和球果于2017 年7 月15 日采自廣州市天河區(qū)華南師范大學(xué)五山校區(qū)。

1.1.2 儀器與試劑

6890N-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；水蒸汽蒸餾裝置：北京永光明醫(yī)療儀器廠；氯化鈉（分析純）：北京化學(xué)試劑公司；無水硫酸鈉（分析純）：北京化學(xué)試劑公司；硫酸鏈霉素（99%）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 落羽杉葉片和球果揮發(fā)油的提取

取985 g落羽杉葉片和1 123 g落羽杉球果，參照劉易等［14］的方法提取落羽杉葉片和球果中揮發(fā)油。

1.2.2 GC-MS分析

測(cè)定所用毛細(xì)管色譜柱為DB-5（30 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度230 ℃，無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。升溫程序參照張偉豪等［15］的方法。

1.2.3 落羽杉葉片和球果揮發(fā)油抗細(xì)菌活性的測(cè)定

由表1 可見，供試菌株共7 種，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院植物和微生物健康實(shí)驗(yàn)室提供。

抗細(xì)菌活性參照單體江等［16］方法略加改進(jìn)。挑取活化好的單菌落，在LB 液體培養(yǎng)基中搖培（28℃，暗，150 rpm） 24 h，用移液槍吸取50 μL 108cfu/mL 菌液加入到冷卻的LB 平板培養(yǎng)基上，用三角玻璃棒涂板。用滅菌的鑷子將滅菌的濾紙片放在培養(yǎng)皿的中央，而后在濾紙片上加入5 μL 揮發(fā)油，24 h 后量取抑菌圈的直徑。陽(yáng)性對(duì)照為5 μL 0.2 mg/mL硫酸鏈霉素，每皿放3個(gè)濾紙片，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 落羽杉葉片和果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分及其相對(duì)百分含量

落羽杉葉片和球果揮發(fā)油的得率（以鮮重計(jì)）分別為0.211%、0.657% ，說明落羽杉球果中揮發(fā)油的含量遠(yuǎn)高于葉片。落羽杉葉片和球果揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)百分含量的結(jié)果見表2。由表2可知，從落羽杉葉片中共鑒定出32 個(gè)成分，占總相對(duì)含量的98.19%，含量最多的3 種成分是D-檸檬烯（23.78%）、1，8-間孟二烯（15.76%）、氧化石竹烯（12.65%）；在球果中共鑒定出15 個(gè)成分，占總相對(duì)含量的95.98%，其中主要成分是D-檸檬烯（38.02%）、5-亞乙基-1-甲基-環(huán)庚烯（11.95%）和鐵銹醇（10.46%），其相對(duì)含量之和為60.43%。

表1 供試菌株

由此可見，落羽杉葉片和球果揮發(fā)油主要以烯醇類成分為主，二者的主要成分均為D-檸檬烯，其相對(duì)含量分別為23.78%和38.02%。此外，落羽杉葉片和球果揮發(fā)油中相同的成分還有6種，分別是3-蒈烯、β-蒎烯、乙酸冰片酯、冰片烯、1-石竹烯和鐵銹醇，除冰片烯外其他5種成分在球果揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量均高于葉片揮發(fā)油。

2.2 落羽杉葉片和球果揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定落羽杉葉片和球果揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性，其結(jié)果見圖1。從圖1 可以看出，除大腸桿菌外（E. coli），球果揮發(fā)油對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性要明顯強(qiáng)于葉片揮發(fā)油，其中，落羽杉球果揮發(fā)油對(duì)溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）的抑制活性最好，抑菌圈直徑為（20.00 ±1.00） mm；其次是桉樹青枯病菌（R. solanacearum），抑菌圈直徑為（17.67 ± 0.58）mm；落羽杉葉片揮發(fā)油均對(duì)溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）和桉樹青枯病菌（R. solanacearum）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為（11.00 ±1.00）mm 和（10.67±0.58）mm。與陽(yáng)性對(duì)照硫酸鏈霉素相比，落羽杉葉片揮發(fā)油的抑菌活性均弱于陽(yáng)性對(duì)照硫酸鏈霉素；而球果揮發(fā)油對(duì)桉樹青枯病菌（R. solanacearum）的抑制活性明顯強(qiáng)于硫酸鏈霉素，對(duì)溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）的抑制活性與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)，對(duì)其他供試細(xì)菌的抑制活性明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照。葉片揮發(fā)油對(duì)番茄瘡痂病菌（X. vesicatoria）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和大腸桿菌（E. coli）幾乎無抑制活性。由此可見，落羽杉葉片和球果揮發(fā)油對(duì)7種細(xì)菌的抑制效果差異較大，落羽杉球果揮發(fā)油的抑菌活性要明顯強(qiáng)于葉片。

圖1 落羽杉葉片和球果揮發(fā)油對(duì)7種供試細(xì)菌的抑制活性

表2 落羽杉葉片和球果揮發(fā)油化學(xué)成分及其相對(duì)百分含量

3 結(jié)論與討論

落羽杉葉片和球果中均含有豐富的揮發(fā)油，球果中揮發(fā)油含量明顯高于葉片。落羽杉葉片和球果揮發(fā)油中的主要成分均為D-檸檬烯，其相對(duì)含量分別為23.78%、38.02%。目前，有關(guān)落羽杉揮發(fā)油的報(bào)道較少，尚未見球果揮發(fā)油化學(xué)成分的報(bào)道。尚兵兵等［17］使用動(dòng)態(tài)頂空氣體循環(huán)法對(duì)落羽杉揮發(fā)性化合物日動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同時(shí)間段落羽杉枝葉揮發(fā)物釋放量和種類，在不同時(shí)間差異明顯。單體江等［18］研究發(fā)現(xiàn)落羽杉變種池杉葉片和球果揮發(fā)油中的主要成分均為（1R） -α-蒎烯，其含量分別為70.15%、78.61%，落羽杉和池杉雖然親緣關(guān)系近，但揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對(duì)含量差異較大，說明揮發(fā)油的組成與植物種類、采樣時(shí)間以及不同的監(jiān)測(cè)分析方法有關(guān)。

α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯等萜烯類化合物可增強(qiáng)空氣的清新感，對(duì)人體具有保健作用；蒎烯及莰烯等成分是天然的驅(qū)蟲殺蟲成分，檸檬烯和石竹烯等化學(xué)成分具有一定的抗菌和消炎作用［18-19］，植物揮發(fā)油具有很好的協(xié)同增效作用［20］。本研究中落羽杉球果揮發(fā)油對(duì)溶血葡萄球菌和桉樹青枯病菌抑制作用顯著，在生物防治上具有重要意義；葉片揮發(fā)油雖抑菌活性不強(qiáng)，但可作為協(xié)同增強(qiáng)劑，具體還有待于進(jìn)一步的研究。本研究為落羽杉葉片及球果揮發(fā)油的開發(fā)利用以及落羽杉在城市公園、園林綠化以及森林保健中心等建設(shè)提供重要的理論依據(jù)。