高效液相色譜法檢測(cè)不同品種柑橘類果皮多甲氧基黃酮

劉洋，方迅，胡爽，凌敏，楊麗珠，徐蘭英

（黃岡師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃岡438000）

柑橘果皮，為蕓香科柑桔屬植物橘（Citrus eticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，可經(jīng)過除去雜質(zhì)、噴淋水、潤(rùn)透、切絲、干燥等一系列炮制過程得到傳統(tǒng)中藥陳皮，有理氣調(diào)中，燥濕化痰的功效[1]。柑橘果皮中含有多種化學(xué)活性成分，包括黃酮類化合物（flavonoids）、生物堿類（alkaloids）、揮發(fā)油類（vplatile oil）、檸檬苦素類（limonoids）、多糖類及微量元素[2-3]。其中多甲氧基黃酮（polymethoxy flavonoids，PMFs）為柑橘特有的化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其有廣泛的生物活性[4-6]，其中甜橙黃酮能顯著抑制癌細(xì)胞的增殖[7]。川陳皮素和陳皮素具有預(yù)防肥胖、輔助降血脂、抗炎的作用[8-12]。5-去甲基多甲氧基黃酮對(duì)人肺[13]、結(jié)腸[14-16]、乳腺[17]和白血病[18]癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗增殖作用。5-去甲基川陳皮素和5-去甲基陳皮素是陳皮中最豐富的5-去甲基多甲氧基黃酮[19-21]。

隨著陳皮研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)，陳皮的藥效及重要生物活性大多與陳皮多甲氧基黃酮相關(guān)。陳皮是由新鮮柑橘果皮制備而得，柑橘果皮中多甲氧基黃酮的種類和含量受到多種環(huán)境條件及不同基因型的影響[22]。柑橘果皮選材不同，所制得陳皮中藥材中多甲氧基黃酮的種類和含量也會(huì)不同，進(jìn)而影響到陳皮的藥效。因此，分析不同品種、不同產(chǎn)地柑橘果皮中多甲氧基黃酮的含量，對(duì)于陳皮的選材及其質(zhì)量控制具有重要意義。目前，已有以紫外分光光度法和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定不同川陳皮中橙皮苷、川陳皮素的含量[23]，也有研究者采用HPLC法測(cè)定不同陳皮藥材中橙皮苷、川陳皮素和陳皮素等的含量[24]，以及用HPLC同時(shí)分析6種5-去甲基多甲氧基黃酮[25]。本文采用高效液相色譜法對(duì)6種主要多甲氧基黃酮（甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、陳皮素、5-去甲氧基川陳皮素、5-去甲基陳皮素）在9種不同品系、產(chǎn)地的柑橘中含量的差異進(jìn)行了檢測(cè)和分析，以期為陳皮的原材料選擇、質(zhì)量合理控制提供一定參考。6種PMFs的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 6種PMFs的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of six PMFs

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘新鮮果實(shí)：京東生鮮水果。

無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多甲氧基黃酮（PMFs）、甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、陳皮素、5-去甲氧基川陳皮素、5-去甲基陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品：催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，純度均大于98%。

1.2 儀器與設(shè)備

GWX-9623MB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6020真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-III循環(huán)水真空泵、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；CCA-20型低溫冷卻水循環(huán)泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BSA124S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DS-5510DT型超聲波清洗器：上海生析超聲儀器有限公司；UPT-II-10T優(yōu)普系列超純水器：成都超純科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本Shimudzu公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC條件

色譜柱：GL Sciences Intersil C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～55%乙腈；15 min～20 min，55%～70%乙腈；20 min～25 min，70%～80%乙腈；25 min～30 min，80%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、橘皮素、5-去甲基川陳皮素、5-去甲基橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg，用色譜甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，將其作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液保存于4℃冰箱中，備用。采用逐步稀釋法得到 0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL 一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣。

1.3.3 柑橘類果皮中多甲氧基黃酮的提取及檢測(cè)

將市售重慶柑橘、安遠(yuǎn)臍橙、浦江美人桔、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔、浦江丑橘、臺(tái)州蜜桔、廣西皇帝柑、贛南臍橙新鮮果實(shí)洗凈烘干，收集果皮，將果皮洗凈于70℃干燥，然后將其粉碎備用。稱取干燥柑橘果皮粉末各1.0 g，用50 mL無水乙醇索氏提取至提取液無色，將提取液減壓濃縮成稠膏狀，稱重。然后將所得稠膏用乙醇溶解，定容至100 mL得樣品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將樣品溶液取上層清液，過0.22 μm濾膜后直接注入進(jìn)樣瓶，按1.3.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)柑橘果皮中多甲氧基黃酮包括甜橙黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、橘皮素、5-去甲基川陳皮素、5-去甲基橘皮素含量，計(jì)算含量時(shí)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。工作曲線繪制時(shí)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為重復(fù)3次的試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離

將6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品混合液，在1.3.1色譜條件下進(jìn)行分離，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，在給定的色譜條件下，6種主要多甲氧基黃酮均具有較好的峰形和分離度。

圖2 多甲氧基黃酮高效液相色譜圖Fig.2 Chromatograph of the six PMFs

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)不同質(zhì)量濃度的多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液分別自動(dòng)進(jìn)樣10 μL，按1.3.1色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸計(jì)算得6種多甲氧基黃酮回歸方程。將最小濃度的6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液繼續(xù)進(jìn)行稀釋，按照1.3.1的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算信噪比。每種黃酮在信噪比（S/N）為3和10處對(duì)應(yīng)的多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），結(jié)果如表1所示。

表1 方法學(xué)考察Table 1 Results of the method investigations

由表1可知，6種多甲氧基黃酮在2.5 μg/mL～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 5。

2.2.2 日內(nèi)和日間精密度

分別取質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL的6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，平行測(cè)定6次，記錄6種多甲氧基黃酮的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）得日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d對(duì)分別配制的6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，記錄6種多甲氧基黃酮的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差得日間精密度，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的日內(nèi)日間精密度均小于2.8%，說明儀器精密度良好，可以滿足試驗(yàn)要求。

表2 日內(nèi)日間精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性Table 2 Results precision，stability and repeatability test

2.2.3 穩(wěn)定性考察

分別配制6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制完成后分別放置 0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)行液相色譜分析，測(cè)定其峰面積，計(jì)算RSD值，考察方法的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。試驗(yàn)表明，6種多甲氧基黃酮在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，除3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮的 RSD 為 1.71%外，其它5種多甲氧基黃酮的RSD均小于0.7%。

2.2.4 重復(fù)性考察

按1.3.3方法平行制備6份樣品溶液，在1.3.1色譜條件下，同時(shí)測(cè)定6種多甲氧基黃酮含量并計(jì)算RSD值，考察方法的穩(wěn)定性，計(jì)算得RSD值均在2%以內(nèi)，結(jié)果見表2，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn)

分別稱取0.50 mg 6種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入1.0 g干燥柑橘果皮粉末，按照1.3.3中的方法進(jìn)行索氏提取、濃縮及溶液配制。將樣品溶液取上層清液，過0.22 μm濾膜后直接注入進(jìn)樣瓶，按1.3.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品加樣回收率，將加樣回收率測(cè)定過程重復(fù)5次并計(jì)算RSD，結(jié)果見表2。由表2可見，6種樣品回收率都在97%至105%之間，回收率RSD值均在2.5%以內(nèi)。

2.2.6 柑橘果皮中6種多甲氧基黃酮含量檢測(cè)

采用建立的液相色譜法對(duì)10種不同品種柑橘果皮提取物中的6種多甲氧基黃酮進(jìn)行了檢測(cè)，采用保留時(shí)間和紫外光譜對(duì)照法對(duì)6種多甲氧基黃酮進(jìn)行歸屬確證。相同色譜條件下，重慶柑橘果皮的液相色譜圖見圖3。

由圖3可見，重慶柑橘果皮中川陳皮素和橘皮素含量均較高，但未檢出5-去甲氧基橘皮素。

圖3 重慶柑橘果皮提取物液相色譜圖Fig.3 Chromatograph of the Chongqing citrus peel extracts

其它品種柑橘類果皮樣品色譜圖未一一在文中列出。根據(jù)液相色譜峰面積，將各多甲氧基黃酮峰面積代入表1回歸方程，計(jì)算對(duì)不同品種中6種PMFs化合物的含量。結(jié)果如表3所示。

由表3可見，不同品種柑橘果皮中的多甲氧基黃酮含量有明顯的差異，在這9種柑橘果皮樣品中，重慶柑橘、浦江美人桔、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔、廣西皇帝柑中總黃酮含量均較高，其中廣西沙糖桔多甲基黃酮總含量高達(dá)11.59 mg/g，果皮中多甲基黃酮總含量最少的品種是臺(tái)州蜜桔（1.11 mg/g）；廣西沙糖桔和浦江美人桔中甜橙黃酮含量較高，分別達(dá)到0.94 mg/g和1.51 mg/g；重慶柑橘、浦江美人桔、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔、廣西皇帝柑中川陳皮素相對(duì)含量較高（含量范圍2.54 mg/g～6.85 mg/g），其中廣西沙糖桔果皮中川陳皮素含量達(dá)到6.85 mg/g；重慶柑橘、廣東皇帝柑、廣西沙糖桔和廣西皇帝柑中橘皮素含量較高（含量范圍1.91 mg/g～3.38 mg/g），其中廣西沙糖桔果皮中橘皮素含量達(dá)到3.38 mg/g；重慶柑橘、浦江美人桔、廣東皇帝柑和廣西皇帝柑中5-去甲基川陳皮素含量較高（含量范圍 0.59 mg/g～0.80 mg/g）；另外，5-去甲基陳皮素在所檢測(cè)的所有品種柑橘果皮中含量均極低，大部分品種的柑橘果皮中都未檢出5-去甲基陳皮素。

表3 不同品種柑橘果皮中6種PMFs含量Table 3 Contents of six PMFs in different varieties of citrus peel

3 結(jié)論

本研究采用乙醇索氏提取結(jié)合高效液相色譜，建立了分離檢測(cè)6種主要多甲氧基黃酮含量的方法。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確為柑橘果皮中多甲氧基黃酮的質(zhì)量檢測(cè)及陳皮中藥材的制備及質(zhì)量控制提供了參考方法和科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為其他天然產(chǎn)物同類化合物的研究提供了思路借鑒。