CaSR986基因多態(tài)性與能譜CT泌尿系結(jié)石成分分析及臨床特征的相關(guān)性

李勤祥，潘愛(ài)珍，徐志鋒，金亞彬，劉偉濤，徐文鋒

（佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見(jiàn)疾病之一，近年，隨著人們生活環(huán)境及飲食習(xí)慣的不斷改變，其發(fā)病率有上升趨勢(shì)，且復(fù)發(fā)率也相對(duì)較高，給患者造成一定的困擾[1-2]。因此尋找相關(guān)原因，探求解決辦法一直是臨床工作者關(guān)注的重點(diǎn)。有研究顯示，泌尿系結(jié)石復(fù)發(fā)與結(jié)石成分密切相關(guān)，而后者又與基因遺傳學(xué)明顯相關(guān)，但具體基因分析研究較為少見(jiàn)[3]。鈣敏感受體（Calcium sensing receptor，CaSR）基因位于人染色體3q13.3-21上，其編碼蛋白是一種重要的G蛋白偶聯(lián)受體，在鈣離子調(diào)節(jié)中占有重要地位[4]。CaSR基因共有7個(gè)外顯子，而CaSR986則是位于第7個(gè)外顯子中的某個(gè)單核苷酸，其主要功能是編碼細(xì)胞外域和跨膜的鈣敏感受體蛋白，可導(dǎo)致含鈣結(jié)石形成[5]。結(jié)石成分不同，其治療方法不盡相同，目前術(shù)后體外紅外光譜分析法是結(jié)石成分分析的金標(biāo)準(zhǔn)，限制了術(shù)前對(duì)結(jié)石成分的準(zhǔn)確判斷從而影響個(gè)體化治療方案的制定，近年來(lái)能譜CT雙能量掃描可彌補(bǔ)此不足，可在體內(nèi)完成此項(xiàng)檢查，為結(jié)石成分分析提供了一個(gè)新的平臺(tái)[6-7]。本研究選取我院收治的98例泌尿系結(jié)石患者和50例健康者作為研究對(duì)象，探討CaSR986基因多態(tài)性與泌尿系結(jié)石成分及臨床特征的相關(guān)性，旨在為臨床個(gè)體化治療提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月—2017年7月于我院收治的98例泌尿系結(jié)石患者作為研究對(duì)象，稱為實(shí)驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)為：①臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查均提示為泌尿系結(jié)石，且為首次診療者；②年齡在18～50歲之間，且均須經(jīng)皮腎鏡或輸尿管鏡取石術(shù)者；③術(shù)前行雙能源CT雙能量掃描，術(shù)后行紅外光譜分析者；④臨床及隨訪資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前雙能CT和術(shù)后紅外光譜結(jié)果分析差異者；②懷孕者或合并泌尿系惡性腫瘤者；③期間或近半年參加相關(guān)研究者；④具有精神病史或家族史者；其中男56例，女42例；平均年齡（34.98±6.18）歲；地區(qū)分布：本地長(zhǎng)期生活達(dá)10年者65例；其它33例。收集同期于我院進(jìn)行體檢的50例健康者作為對(duì)照組，排除具有泌尿系結(jié)石家族史者；其中男28例，女22例；平均年齡（35.08±6.69）歲；地區(qū)分布：本地長(zhǎng)期生活達(dá)10年者34例；其它16例。兩組在性別、年齡及地區(qū)分布等一般資料上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 CaSR986基因多態(tài)性檢測(cè)

1.2.1 血液標(biāo)本收集及保存

囑所有患者于入組當(dāng)天抽取5 mL外周靜脈血（EDTA抗凝），3 000 r/min低溫高速離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存，待所有標(biāo)本集齊后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 DNA提取

參考外周血基因組DNA提取試劑盒 （美國(guó)Merck公司）操作說(shuō)明書(shū)完成DNA提取，后采用GENESYSTM180紫外分光光度儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）檢測(cè)其濃度、純度，質(zhì)量合格者進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 PCR引物設(shè)計(jì)

參考Gene Bank中CaSR基因中第7外顯子986突變位點(diǎn)上下游序列，使用Primer 6.0軟件完成引物設(shè)計(jì)，后由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成其合成和測(cè)序驗(yàn)證，序列正確。其中上游引物序列為5’-CAGAAGGTCATCTTTGGCAGCGGCA-3’，下游引物序列為5’-TCTTCCTCAGAGGAAAGGAGTCTGG-3’。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系：①總體積50 μL；②內(nèi)容物：4μLDNA模板、各4 μL上下游引物（0.5 μmol/L）、4 μL dNTP混合液 （200 μmol/L）、0.5 μLTaqDNA聚合酶（5U）、4 μL Mgcl2（1.5 mmol/L）及28.5 μL Buffer；③反應(yīng)條件：按95℃10 min預(yù)變性、95℃30 s變性、60℃1 min退火、72℃1 min延伸，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min終末延伸。其中產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為450bp。

1.2.5 CaSR986基因多態(tài)性分析

參考PCR產(chǎn)物純化試劑盒（購(gòu)于美國(guó)Merck公司）操作說(shuō)明書(shū)完成PCR產(chǎn)物純化和回收，后將其送至上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 結(jié)石成分分析

術(shù)前，采用寶石能譜 CT （Discovery CT 750HD，GE Healthcare）對(duì)實(shí)驗(yàn)組患者體內(nèi)結(jié)石進(jìn)行檢查，掃描范圍為雙腎上極至恥骨聯(lián)合水平；掃描參數(shù)：GSI模式，掃描管電壓120 kVp，管電流150 mAs，探測(cè)器準(zhǔn)直0.625 mm×64 mm，螺距0.984，球管轉(zhuǎn)速1 s/r，DFOV 12 cm，矩陣512×512。原始數(shù)據(jù)傳至GEAW 4.6工作站，由1名有多年工作經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師在GSI模式下測(cè)量所有結(jié)石的有效原子序數(shù)（Eff-Z）。選取結(jié)石最大層面手工勾畫(huà)感興趣區(qū)（ROI），盡可能包含結(jié)石，依據(jù)Eff-Z峰值和能譜曲線按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（NIST）已知物質(zhì)進(jìn)行比較判定結(jié)石主要成分。術(shù)后，采用LIIR-20紅外光譜自動(dòng)分析儀（天津藍(lán)莫德科學(xué)儀器有限公司）對(duì)實(shí)驗(yàn)組患者取出結(jié)石進(jìn)行成分分析。

在本研究中，主要將結(jié)石成分分為兩類：含鈣結(jié)石和非含鈣結(jié)石兩種類型。

1.4 隨訪

術(shù)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組患者隨訪1年，每次間隔2月，主要通過(guò)電話、微信、上門(mén)和入院復(fù)查等方式進(jìn)行。對(duì)疑似復(fù)發(fā)者囑其立即入院完成相關(guān)檢查，尤其強(qiáng)調(diào)行能譜CT復(fù)查其再發(fā)結(jié)石成分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，其中基因頻率分布采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比（%）描述，用χ2或Fisher精確檢驗(yàn)比較；采用Pearson法分析CaSR986基因型分布與結(jié)石成分之間的關(guān)系；采用Logistic回歸法分析影響結(jié)石復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；按α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)；以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)CaSR986基因有AA、AS和SS三種基因型，以AA純合子基因型比較高；采用擬和優(yōu)度卡方檢驗(yàn)分析其基因頻率分布，符合Hardy-Weinberg定律（P>0.05），具有群體代表性。

2.2 兩組CaSR986基因多態(tài)性比較

CaSR986基因型及等位基因構(gòu)成比在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具體見(jiàn)表1。

2.3 實(shí)驗(yàn)組結(jié)石成分分析

在本研究中，實(shí)驗(yàn)組含鈣結(jié)石75例（圖1），非含鈣結(jié)石23例（圖2）。

2.4 CaSR986基因型與結(jié)石成分相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得知，含鈣結(jié)石與CaSR986 AA型呈現(xiàn)明顯正相關(guān)（r=0.734，P<0.05）；而含鈣結(jié)石與CaSR986其它基因型、非含鈣結(jié)石與CaSR986任何基因型均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。

2.5 CaSR986基因型與臨床特征之間的關(guān)系

CaSR986基因型分布在結(jié)石部位、結(jié)石復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)結(jié)石成分上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）：其中AA型與腎結(jié)石、AS型與膀胱結(jié)石及SS型與尿道結(jié)石相關(guān)性較大；AA型與結(jié)石復(fù)發(fā)及含鈣結(jié)石成分密切相關(guān)，但在結(jié)石直徑及腎積水方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具體見(jiàn)表2。

2.6 泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)Logistic回歸分析

將年齡、性別、結(jié)石部位、結(jié)石成分、結(jié)石直徑、腎積水情況及CaSR986基因型納入Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)：結(jié)石部位、結(jié)石成分及CaSR986基因型與泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)相關(guān)（P<0.05），在校正性別及年齡混雜因素后再次進(jìn)行Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)結(jié)石成分是影響泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。

表1 兩組CaSR986基因多態(tài)性比較

圖1，2 HDCT結(jié)石成分分析結(jié)果圖。圖1為含鈣結(jié)石（草酸鈣結(jié)石），圖2為非含鈣結(jié)石（尿酸結(jié)石）。Figure 1,2.The results of HDCT stone composition analysis.Figure 1:Calcium-containing calculus (calcium oxalate stone),Figure 2:Non-calcium stone(uric acid stone).

表2 CaSR986基因型與臨床特征之間的關(guān)系

3 討論

泌尿結(jié)石發(fā)生及復(fù)發(fā)機(jī)制截止目前仍不十分清楚，可能與環(huán)境因素、遺傳因素及個(gè)體因素等有關(guān)[8]。目前有學(xué)者認(rèn)為遺傳因素在其中占有一定地位，且與結(jié)石成分相關(guān)[9]。CaSR基因可在人體各個(gè)組織中分布，以腎臟和甲狀旁腺為主，在感應(yīng)細(xì)胞外鈣離子變化后通過(guò)介導(dǎo)甲狀旁腺激素 （Parathyroid hormone，PTH）釋放和促進(jìn)腎小管細(xì)胞對(duì)鈣的吸收，在保證體內(nèi)鈣平衡方面占有重要地位[10]。大部分學(xué)者認(rèn)為腎臟鈣調(diào)節(jié)功能與泌尿系含鈣結(jié)石形成密切相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CaSR是影響尿鈣重吸收的重要基因之一，基因形態(tài)不同其相關(guān)性有所差異[11-12]。在CaSR基因第7個(gè)外顯子中包含3個(gè)單核苷酸（Single nucleotide polymorphisms，SNP），分別為986S、990G和1011Q，均可導(dǎo)致含鈣結(jié)石形成，基因多態(tài)性不同，可呈現(xiàn)不同結(jié)果[13]。能譜CT是近年來(lái)醫(yī)學(xué)影像學(xué)發(fā)展史上又一突破，可在治療前大致了解結(jié)石成分，為其治療方案的選擇提供了方向，有效提高了其治愈率[14]。

本研究則主要針對(duì)CaSR986基因，探討其多態(tài)性與能譜CT泌尿系結(jié)石成分分析結(jié)果及臨床特征的相關(guān)性。本研究完成了98例泌尿系結(jié)石和50例健康體檢者外周血血清的DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩組CaSR986基因分布符合Hardy-Weinberg定律，且均以AA純合子最為常見(jiàn)，這與國(guó)內(nèi)外主要觀點(diǎn)一致[15-16]。兩組CaSR986基因基因型及等位基因構(gòu)成比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得知，含鈣結(jié)石與CaSR986 AA型呈現(xiàn)明顯正相關(guān) （r=0.734，P<0.05），提示含鈣結(jié)石形成與CaSR986基因密切相關(guān)，其具體調(diào)控機(jī)制未在本實(shí)驗(yàn)中得到探討，有待后續(xù)繼續(xù)研究。此外，本研究通過(guò)分析CaSR986基因型與臨床特征之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)CaSR986基因型分布在結(jié)石部位、結(jié)石復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)結(jié)石成分上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示臨床工作者可通過(guò)檢測(cè)患者CaSR986 SNP，幫助發(fā)現(xiàn)隱秘部位細(xì)小結(jié)石和預(yù)測(cè)患者預(yù)后，具有一定臨床價(jià)值。

最后，本研究還進(jìn)行了泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)石成分是影響泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），提示臨床工作者應(yīng)該關(guān)注泌尿系結(jié)石患者結(jié)石成分的準(zhǔn)確分析，與前面結(jié)論聯(lián)合再次強(qiáng)調(diào)了基因多態(tài)性與寶石能譜CT聯(lián)合檢測(cè)在泌尿系結(jié)石診療及預(yù)后監(jiān)測(cè)中的重要意義。

綜上所述，寶石能譜CT可在術(shù)前分辨含鈣結(jié)石，對(duì)泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)具有一定價(jià)值，與CaSR986 AA基因型密切相關(guān)。