維甲酸誘導(dǎo)N2A 細(xì)胞分化過(guò)程中CD2AP對(duì)突觸可塑性的調(diào)控

劉德山 陳佃福 張旭

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一種常見(jiàn)的、與老化密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,其發(fā)病率卻逐年升高［1］,AD 預(yù)期的發(fā)病率將達(dá)到2001年的300%［2］。迄今已發(fā)現(xiàn)多個(gè)AD 的致病基因,如APP 基因、早老素基因1(PS1)和早老素基因 2(PS2)等,國(guó)際上多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)發(fā)現(xiàn)了一系列散發(fā)性AD 的易感基因［3,4］,前期研究提示CD2AP 表達(dá)水平下降可能參與AD 的發(fā)?。?］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CD2AP 在腎臟疾病中的致病機(jī)制研究較多,發(fā)現(xiàn)其參與多個(gè)信號(hào)通路并在維持細(xì)胞骨架中起著重要作用［6］。近期有國(guó)內(nèi)外研究［7］以及本團(tuán)隊(duì)前期的研究均提示CD2AP 參與AD的病理過(guò)程,但其在AD 發(fā)病中的具體機(jī)制仍不清楚。

突觸相關(guān)的結(jié)構(gòu)組成主要包括Actin 細(xì)胞骨架、突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic dentisy,PSD)、谷氨酸受體等神經(jīng)遞質(zhì)受體和一些信號(hào)蛋白分子等。在研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用全反式維甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)干預(yù)N2A 細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)CD2AP 的表達(dá)明顯升高,N2A 細(xì)胞神經(jīng)突起明顯變長(zhǎng),轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)CD2AP 后,神經(jīng)突起顯著變長(zhǎng),而轉(zhuǎn)染shRNA 下調(diào)CD2AP 的表達(dá)水平后,神經(jīng)突起顯著變短,提示CD2AP 在神經(jīng)元骨架的形成中起著重要作用,提示CD2AP 可能在神經(jīng)元突觸可塑性中起著重要作用。有研究報(bào)道神經(jīng)元受損后在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用下,CD2AP 可參與影響神經(jīng)元骨架蛋白Actin 及受體的內(nèi)吞作用。CD2AP 作為信號(hào)通路與細(xì)胞骨架重要的聯(lián)系分子,可與微絲骨架結(jié)合蛋白相互作用,在谷氨酸的誘導(dǎo)下,參與突觸形成、遷移等過(guò)程,本研究將通過(guò)體外ATRA 誘導(dǎo)N2A 細(xì)胞神經(jīng)突起的生長(zhǎng),探討CD2AP 如何調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的生長(zhǎng),為后續(xù)深入研究CD2AP 如何調(diào)控突觸可塑性提供重要理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ①細(xì)胞系：SH-SY5Y 細(xì)胞：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；N2A 細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)室保種。②病毒：shRNACD2AP：山東維真公司；overexpressionCD2AP：上海吉?jiǎng)P公司。

1.2 方法

1.2.1 ATRA 干預(yù)N2A 細(xì)胞 復(fù)蘇N2A 細(xì)胞應(yīng)用ATRA 干預(yù)(干預(yù)濃度為20 μmol/L,干預(yù)時(shí)間為5 d)后,密切觀察細(xì)胞狀態(tài),繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 病毒轉(zhuǎn)染 利用維真公司包裝的shRNACD2AP病毒和吉?jiǎng)P公司overexpressionCD2AP 病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；感染約72 h,觀察感染效率,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光 細(xì)胞爬片經(jīng)處理后,放入12 孔板各孔中并于多聚賴(lài)氨酸進(jìn)行包被。在轉(zhuǎn)染前1 d 鋪細(xì)胞(N2A),每孔鋪約1×105個(gè)細(xì)胞。第2 天轉(zhuǎn)染病毒或進(jìn)行ATRA 干預(yù)、轉(zhuǎn)染或干預(yù)后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。

1.2.4 Western blot 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞,抽提的總蛋白,采用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,電泳、轉(zhuǎn)膜后用封閉液稀釋抗體［兔抗CD2AP單克隆抗體(1∶1000)、鼠抗GAPDH(1∶1000)、鼠抗β-actin(1∶1000)］,孵育4℃過(guò)夜,用TBST 洗膜,再用封閉液稀釋相應(yīng)的二抗,室溫下孵育1 h,TBST 洗膜后,采用Millipore 公司ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色,應(yīng)用Image Lab 軟件進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像、分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Western blot 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,進(jìn)行Levene 方差齊性檢驗(yàn),方差齊時(shí),組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí),采用Games-Howell 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

ATRA 誘導(dǎo)N2A 細(xì)胞后,CD2AP 的表達(dá)明顯升高,N2A 細(xì)胞神經(jīng)突起明顯變長(zhǎng)；上調(diào)、下調(diào)N2A 細(xì)胞中的CD2AP 后,細(xì)胞突起顯著變長(zhǎng),ATRA 通過(guò)調(diào)控CD2AP 表達(dá)影響神經(jīng)突起生長(zhǎng)。

CD2AP 參與生長(zhǎng)因子信號(hào)的蛋白復(fù)合物的支架,CD2AP mRNA 和蛋白在大腦中均有表達(dá),Allen 腦圖譜表明CD2AP mRNA存在于特定區(qū)域的成年大鼠大腦中,特別是具有可塑性高的區(qū)域,為了確定CD2AP 是否參與對(duì)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)的調(diào)節(jié),在應(yīng)用ATRA 進(jìn)行干預(yù)(干預(yù)濃度為20 μmol/L,干預(yù)時(shí)間為5 d)的N2A 細(xì)胞中檢測(cè)了CD2AP 的表達(dá)情況。免疫熒光結(jié)果表明,N2A 細(xì)胞應(yīng)用ATRA 干預(yù)后,其神經(jīng)突起長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。同時(shí),Western blot 法檢測(cè)結(jié)果表明ATRA 干預(yù)后,CD2AP 蛋白表達(dá)水平呈顯著升高。結(jié)果表明CD2AP蛋白水平受到ATRA 的正調(diào)控,并在N2A 細(xì)胞神經(jīng)突起生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用。

為進(jìn)一步研究CD2AP 對(duì)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的調(diào)控,應(yīng)用shRNACD2AP 和overexpressionCD2AP 兩種病毒分別對(duì)N2A 細(xì)胞進(jìn)行上調(diào)和下調(diào)CD2AP 蛋白水平的干預(yù)。72 h 后,overexpressionCD2AP 轉(zhuǎn)染W(wǎng)estern blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD2AP 的表達(dá)量呈顯著升高,細(xì)胞神經(jīng)突起長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)。見(jiàn)圖2。相反的,轉(zhuǎn)染shRNACD2AP 介導(dǎo)的CD2AP 表達(dá)減少導(dǎo)致了與蛋白質(zhì)的減少程度一致的神經(jīng)突起的長(zhǎng)度顯著降低。見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示,CD2AP 蛋白可能參與了神經(jīng)突起生長(zhǎng)的調(diào)控。

圖1 在N2A 細(xì)胞分化突起生長(zhǎng)過(guò)程中CD2AP 表達(dá)水平顯著升高

圖2 overexpressionCD2AP 干預(yù)N2A 細(xì)胞后CD2AP 表達(dá)水平顯著升高、神經(jīng)突起顯著變長(zhǎng)

圖3 shRNACD2AP 干預(yù)N2A 細(xì)胞后,N2A 細(xì)胞CD2AP 表達(dá)下調(diào)、神經(jīng)突起變短

3 討論

AD 其主要臨床表現(xiàn)為慢性、進(jìn)行性認(rèn)知功能損害,其起病隱襲,初始癥狀表現(xiàn)為記憶力缺失,癥狀會(huì)隨著病情進(jìn)展逐漸加重,認(rèn)知和記憶功能不斷惡化,AD 患者認(rèn)知功能下降主要與突觸功能的異常相關(guān),且突觸功能紊亂常常早于突觸的丟失。突觸前和突觸后相關(guān)蛋白均出現(xiàn)不同程度的下降,而且與認(rèn)知功能的下降明顯相關(guān),可見(jiàn)突觸功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)以及維持與突觸相關(guān)蛋白的正常表達(dá)密不可分。突觸相關(guān)蛋白是突觸可塑性重要的分子基礎(chǔ)。有研究報(bào)道包括突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化是AD 患者和AD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦部最早出現(xiàn)的表型,并且突觸水平的變化和認(rèn)知功能損害的程度密切相關(guān)。而與突觸相關(guān)的結(jié)構(gòu)組成主要包括Actin 細(xì)胞骨架、突觸后致密物質(zhì)、谷氨酸受體［主要包括N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)］等神經(jīng)遞質(zhì)受體和一些信號(hào)蛋白分子等。影響上述分子和信號(hào)通路的因素均可能影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而可影響突觸可塑性。

在本研究中,應(yīng)用ATRA 干預(yù)N2A 細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)CD2AP 的表達(dá)明顯升高,N2A 細(xì)胞神經(jīng)突起明顯變長(zhǎng),轉(zhuǎn)染overexpressionCD2AP 病毒后,CD2AP 過(guò)表達(dá),神經(jīng)突起顯著變長(zhǎng),而轉(zhuǎn)染shRNA 下調(diào)CD2AP 的表達(dá)水平后,神經(jīng)突起顯著變短,提示CD2AP 在神經(jīng)元骨架的形成中起著重要作用。這和既往在腎病研究中報(bào)道的CD2AP 對(duì)調(diào)節(jié)足細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用的結(jié)果相一致［5］,提示CD2AP 可能在神經(jīng)元突觸可塑性中起著重要作用。

總之,ATRA 干預(yù)N2A 細(xì)胞后可上調(diào)CD2AP 的表達(dá),或者overexpressionCD2AP 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上調(diào)CD2AP的表達(dá)后,都可促進(jìn)N2A 細(xì)胞神經(jīng)突起的生長(zhǎng),而shRNACD2AP 下調(diào)CD2AP 的表達(dá)后,神經(jīng)突起顯著變短,進(jìn)而說(shuō)明CD2AP 在神經(jīng)突觸生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用,目前有大量的研究表明AD 患者認(rèn)知功能下降,其主要原因是突觸功能障礙［6,7］。這些結(jié)果對(duì)理解CD2AP 基因增加AD 易感性的特點(diǎn)提供了重要信息,從而為深入研究CD2AP 增加AD 易感性的發(fā)生機(jī)制獲得一點(diǎn)啟示,同時(shí)也為今后的研究提供了依據(jù),在后續(xù)的研究中進(jìn)一步深入探討CD2AP 調(diào)控突觸可塑性的信號(hào)通路。