竹葉抗氧化物結(jié)合殼聚糖對青魚片貯藏品質(zhì)的影響

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

青魚（black carp）又名黑鯇、螺螄青，屬鯉形目、鯉科的雅羅魚亞科。主要分布于我國長江以南的平原地區(qū)，是長江中、下游和沿江湖泊里的重要漁業(yè)資源，2014年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量約為55.7萬噸，為我國淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一[1]。青魚肉質(zhì)鮮美肥膩，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)，但宰殺后由于其營養(yǎng)豐富，極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，因此尋求行之有效的保鮮技術(shù)具有重要的研究意義[2]。

近年來，由于天然生物保鮮劑具有安全、高效和方便等特點(diǎn)，已成為農(nóng)產(chǎn)品、肉品、水產(chǎn)品等品質(zhì)保鮮的研究熱點(diǎn)[3]。竹葉抗氧化物（bamboo leaf antioxidants，AOB）是從竹葉中提取的抗氧化性成分，有效成分包括黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物，于2004年列入GB2760-1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，允許其作為天然食品抗氧化劑在水產(chǎn)品中使用[4]。張曉麗等[5]研究表明竹葉抗氧化物對鮮羅非魚片具有良好的抗菌和抗氧化作用。殼聚糖（chitosan）又稱脫乙酰甲殼素，是甲殼素經(jīng)化學(xué)處理脫乙酰基后的產(chǎn)物，是惟一的堿性天然多糖，在自然界中含量豐富，無毒安全，在各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[6]。因殼聚糖分子中帶有游離氨基，在酸性溶液中易成鹽，呈陽離子性質(zhì)。能抑制一些真菌、細(xì)菌和病毒的生長繁殖。周強(qiáng)等[7]研究表明，殼聚糖復(fù)合膜組能有效保持魚肉的感官品質(zhì)，防止草魚肉營養(yǎng)價值及鮮度的下降。陳軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)冰溫結(jié)合殼聚糖涂膜處理能有效的提高草魚片的保鮮效果，使草魚片的貨架期由9 d延長至15 d～18 d。

目前國內(nèi)外將竹葉抗氧化物結(jié)合殼聚糖應(yīng)用到青魚保鮮的研究還未見報道。本文以竹葉抗氧化物和殼聚糖為復(fù)合保鮮劑，探究其對青魚在4℃貯藏條件下的品質(zhì)影響，為延長青魚貨架期提供理論支持和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮青魚：泰州市海陵區(qū)農(nóng)貿(mào)市場；PE保鮮袋：泰州市大潤發(fā)超市。

竹葉抗氧化物（總黃酮含量≥10%）（食品級）：河南豫中生物科技有限公司；殼聚糖（脫乙酰度≥90%）（食品級）：國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；氧化鎂、硼酸、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、甲基紅、亞甲基藍(lán)、1-丁醇、2-硫代巴比妥酸（分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基生化試劑：青島高科海博生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosinix acid，IMP）、次黃嘌呤（inosine，Hx）、次黃嘌呤核苷（inosine，HxR）（純度均＞99%）：美國 Sigma公司。其他常用試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。

1260 Infinity高效液相色譜儀、SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，粒徑 5 μm）：美國 Agilent公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KDN-04B半自動凱氏定氮儀：上海右一儀器有限公司；G154DW立式壓力蒸汽滅菌鍋：山東省諸城市食品機(jī)械有限公司；BGZ-240電熱恒溫干燥箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱：廣州滬瑞明儀器有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

鮮活青魚去除魚頭、魚尾、魚鱗和內(nèi)臟后，用無菌水洗凈，自然瀝干水分，取其脊背部魚肉切成1 cm～2 cm厚的魚片（約30 g），分別在特定濃度配比的保鮮劑溶液中浸漬5 min，取出瀝干，用無菌食品自封袋分裝并編號，置于4℃環(huán)境下貯藏。

1.2.2 復(fù)合保鮮劑最佳配比的確定

參考GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對食品中添加劑的使用量規(guī)定[9]（竹葉抗氧化物和殼聚糖在水產(chǎn)品中的最高許可用量分別為0.5 g/kg和6 g/kg），將一定量的竹葉抗氧化物、殼聚糖分別溶解于水和含有1%醋酸的水溶液中，配成不同濃度的單一生物保鮮劑[10]。由預(yù)試驗的研究結(jié)果可知，竹葉抗氧化物溶液濃度為2 g/L，殼聚糖濃度為15 g/L保鮮效果較好。因此本試驗采用竹葉抗氧化物、殼聚糖的取值水平分別為1 g/L～3 g/L和10 g/L～20 g/L，將不添加任何保鮮劑的0.5%醋酸溶液處理組作為空白對照組，試驗設(shè)計如表1所示。

表1 試驗設(shè)計表Table 1 Design for experimentation

按照表1的不同處理組處理青魚片后，于4℃環(huán)境下貯藏5 d后進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮含量檢測，確定最佳的復(fù)合保鮮劑配比。

1.2.3 復(fù)合保鮮劑對草魚片貯藏品質(zhì)的影響

選擇最佳配比濃度的復(fù)合液處理魚體作為試驗組，不經(jīng)復(fù)合液處理的魚體作為空白對照組，對其在4℃貯藏溫度下進(jìn)行綜合感官評定，并測定其揮發(fā)性鹽基氮含量（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid，TBA值）、K值和菌落總數(shù)的變化，每隔2 d測定魚體1次。

1.2.4 鮮度指標(biāo)檢測方法

1.2.4.1 綜合感官評定

依據(jù)GB 2733-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動物性水產(chǎn)品》[11]，感官評定由受專門培訓(xùn)的感官評定小組6人（3男3女），對各處理組青魚片的色澤、氣味、狀態(tài)等進(jìn)行綜合評分，最后取其綜合評分值[12]，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。色澤、氣味、狀態(tài)權(quán)重分別為0.3、0.4、0.3，計算加權(quán)平均分。最高分為5分，最低分為1分，3分以下評定為不合格，已不新鮮，不再適合食用。

表2 青魚片感官評分標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 The sensory evaluation standard table of black carp fillet

續(xù)表2 青魚片感官評分標(biāo)準(zhǔn)表Continue table 2 The sensory evaluation standard table of black carp fillet

1.2.4.2 揮發(fā)性鹽基氮含量測定

參照GB5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的自動凱氏定氮儀法[12]。

1.2.4.3 硫代巴比妥酸值（TBA）測定

參照GB/T35252-2017《動植物油脂2-硫代巴比妥酸值的測定直接法》[13]。

稱取2 g（m）魚肉糜，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用1-丁醇溶解并稀釋至刻度，吸取5 mL樣品液加入具塞試管中，加入5 mLTBA試劑，充分混勻。將具塞試管置于95℃水浴鍋中加熱2 h，冷卻至室溫（25℃）。將具塞試管中的溶液轉(zhuǎn)移到干凈、干燥的10 mm比色皿中，用蒸餾水在530 nm處校正分光光度計零點(diǎn)，測定溶液吸光度（A）同時做試劑空白，測定試劑空白吸光度（B）。TBA值按以下公式計算。

式中：A為被測溶液的吸光度；B為空白試劑的吸光度；m為樣品的質(zhì)量，mg；50為試樣用1-丁醇稀釋至25 mL并用10 mm比色皿測定吸光度的有效因子。

1.2.4.4 K值的測定

參照SC/T 3048-2014《魚類鮮度指標(biāo)K值的測定高效液相色譜法》[14]。稱取均質(zhì)后的魚肉樣品（2.00±0.02）g放入離心管內(nèi)，加入10%的高氯酸溶液20 mL，渦旋振蕩1 min，在4℃下8 000 r/min離心10 min，取出上清液，再用5%高氯酸溶液10 mL提取沉淀物中的待測物，在4℃下8 000 r/min離心10 min。重復(fù)操作1次，合并上清液。用10 mol/L的NaOH溶液調(diào)提取液pH值近6.0，然后再用1 mol/L的NaOH溶液繼續(xù)調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.4。將已調(diào)好pH值后的溶液移至經(jīng)預(yù)冷的容量瓶中，用4℃蒸餾水定容至50 mL。在4℃下8 000 r/min離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液于4℃下保存，待測。

K值計算公式：

式中：MHxR為次黃嘌呤核苷含量，μmol/g；MHx為次黃嘌呤含量，μmol/g；MATP為三磷酸腺苷含量，μmol/g；MADP為二磷酸腺苷含量，μmol/g；MAMP為腺苷酸含量，μmol/g；MIMP為肌苷酸含量，μmol/g。

1.2.4.5 菌落總數(shù)測定

參照GB4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》中的平板計數(shù)法進(jìn)行測定[15]。

稱取25 g碎青魚肉置盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/min～10 000 r/min均質(zhì) 1 min～2 min，制成料液比為1∶10（g/mL）的樣品勻液。并依次進(jìn)行10倍遞增稀釋處理，最終在1∶100和1∶1000稀釋液中取1 mL涂布在培養(yǎng)基表面，（30±1）℃培養(yǎng)（72±3）h，每個稀釋梯度最少做2個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合保鮮劑最佳配比的確定

青魚片經(jīng)茶多酚和殼聚糖復(fù)合液處理后，在4℃環(huán)境下貯藏5 d后的TVB-N含量，如圖1所示。

圖1 青魚片經(jīng)不同比例復(fù)合保鮮劑處理5 d后的TVB-N值Fig.1 TVB-N Value of black carp fillet treated with different proportions of compound preservative for 5 days

由圖1可知，青魚片分別經(jīng)9組A2至A10不同比例復(fù)合保鮮劑處理后，TVB-N值均顯著低于空白對照組A1組，其中，A9組TVB-N值最低，說明3g/L竹葉抗氧化物與15 g/L殼聚糖組成的復(fù)合保鮮劑保鮮效果最好，因此，選擇3 g/L竹葉抗氧化物與15 g/L殼聚糖作為最佳復(fù)合保鮮劑進(jìn)行后續(xù)對青魚片貯藏品質(zhì)的研究。

2.2 復(fù)合保鮮劑處理對青魚片貯藏品質(zhì)的影響

2.2.1 復(fù)合保鮮劑對青魚片在貯藏中感官品質(zhì)的影響

魚肉中脂肪氧化酸敗產(chǎn)生丙二醛等物質(zhì)，蛋白質(zhì)在酶及微生物作用分解產(chǎn)生氨、三甲胺、硫化氫等物質(zhì)，這些物質(zhì)均會使魚體產(chǎn)生腐敗性的刺鼻氣味。微生物代謝產(chǎn)物及脂肪氧化導(dǎo)致的色素分解會使魚肉色澤發(fā)生變化；由于蛋白質(zhì)的分解使得魚肉組織結(jié)構(gòu)受到破壞致使魚肉組織松散、無彈性，組織狀態(tài)發(fā)生變化[16]。青魚貯藏期間感官評分的變化如圖2所示。

圖2 青魚片貯藏過程中感官評分的變化Fig.2 Changes of sensory score in the storage of black carp fillets

由圖2可知，貯藏期間復(fù)合保鮮劑組和空白對照組的感官評分值均隨著時間的延長而下降。空白對照組感官評分值下降趨勢較復(fù)合保鮮劑組顯著，在第8天時感官評分值僅為3.08±0.01，而復(fù)合保鮮劑組感官評分值在整個貯藏期間下降緩慢，感官評分值均高于空白對照組，在第14天時仍大于3，說明復(fù)合保鮮劑能顯著抑制魚肉感官品質(zhì)下降，使其在較長時間內(nèi)維持良好的貯藏品質(zhì)。

2.2.2 復(fù)合保鮮劑對青魚片在貯藏中TVB-N含量的影響

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是指動物性食品中蛋白質(zhì)由于肌肉內(nèi)源酶或微生物的作用，分解而產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮揮發(fā)性物質(zhì)[17]。TVB-N值通常作為水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的評定指標(biāo)。GB2733-2015規(guī)定，淡水魚蝦的TVB-N值≤20 mg/100 g[11]。青魚在4℃貯藏過程中的TVB-N含量變化如圖3所示。

圖3 青魚片貯藏過程中TVB-N值的變化Fig.3 Changes of TVB-N value in the storage of black carp fillets

由圖3可知，在4℃貯藏條件下，復(fù)合保鮮劑組和空白對照組的TVB-N含量在貯藏初期（0～4 d）差異不顯著。隨著貯藏時間的增加，空白對照組的TVB-N含量急劇上升，而復(fù)合保鮮劑組的TVB-N含量上升較緩慢，兩組差異逐漸增大?？瞻讓φ战M在貯藏8 d時的TVB-N含量已達(dá)（20.32±0.02）mg/g，超過了國標(biāo)規(guī)定的20 mg/100 g的上限值。復(fù)合保鮮劑組樣品貯藏8d時的 TVB-N 含量為（8.52±0.01）mg/g，8 d后 TVBN值上升較之前稍快，到第14天時，TVB-N含量為（30.38±0.02）mg/g，達(dá)到上限值。說明竹葉抗氧化物-殼聚糖復(fù)合保鮮劑的添加減緩了TVB-N的生成，可使青魚在4℃貯藏溫度下的貨架期由6 d～8 d延長至12 d～14 d。

2.2.3 復(fù)合保鮮劑對青魚片在貯藏中TBA值的影響

TBA是反映脂肪氧化程度的重要指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于測定肉類、水產(chǎn)品等產(chǎn)品的脂肪氧化酸敗程度。TBA值越大，說明脂肪氧化腐敗程度越高，魚肉的腐敗程度越高，魚肉的品質(zhì)越低。青魚在貯藏期間TBA值變化如圖4所示。

圖4 青魚片貯藏過程中TBA值的變化Fig.4 Changes of TBA value in the storage of black carp fillets

由圖4可知，隨著時間的延長復(fù)合保鮮劑組和空白對照組的TBA值均逐漸增大，呈不斷上升趨勢。復(fù)合保鮮劑組在整個貯藏期間的TBA值均顯著低于空白對照組，在貯藏第10天時，空白對照組的TBA值達(dá)到了0.138±0.004，而復(fù)合保鮮劑組的TBA值變化幅度不大，從初始的0.018±0.001才上升至0.082±0.002。表明竹葉抗氧化物和殼聚糖復(fù)合保鮮液能明顯抑制不飽和脂肪酸的氧化分解，減少丙二醛的生成，從而延緩青魚片的貨架期。

2.2.4 復(fù)合保鮮劑對青魚片在貯藏中K值的影響

K值是評價水產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要鮮度指標(biāo)，反映了水產(chǎn)品初期三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）的降解程度。一般來講，鮮殺魚的K值通常低于10%，K值在20%以下為一級鮮度，可作為生食魚肉，K值在20%～40%為二級鮮度，K值在60%～80%為初期腐敗。青魚在貯藏期間K值變化如圖5所示。

圖5 青魚片貯藏過程中K值的變化Fig.5 Changes of K value in the storage of black carp fillets

由圖5可知，空白對照組K值增長速率較快，貯藏至6 d時為（45.87±0.01）%，超過了二級鮮度，貯藏至8 d時為（60.32±0.02）%，已開始腐敗變質(zhì)。復(fù)合保鮮劑組貯藏10 d時K值為（35.88±0.01）%，仍在二級鮮度范圍，貯藏14 d時為（59.32±0.02）%，接近腐敗變質(zhì)的上限，說明竹葉抗氧化物和殼聚糖復(fù)合保鮮液能有效抑制微生物的生長繁殖，抑制魚肉中的核苷酸酶的活性，從而減少AMP的降解，表現(xiàn)出較好的貯藏效果。

2.2.5 復(fù)合保鮮劑對青魚片在貯藏中菌落總數(shù)的影響

魚肉的腐敗與細(xì)菌的生長繁殖密切相關(guān)，魚肉中菌落總數(shù)是反映魚類腐敗程度的重要指標(biāo)。圖6為青魚在貯藏過程中的菌落總數(shù)變化[18-19]。

圖6 青魚片貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig.6 Changes of colony count in the storage of black carp fillets

由圖6可知，空白對照組與復(fù)合保鮮劑組魚肉樣品的菌落總數(shù)均隨著貯藏時間的延長而逐漸增加。在整個10 d的貯藏期內(nèi)，空白對照組菌落總數(shù)均高于復(fù)合保鮮劑組?？瞻讓φ战M在貯藏第8天時，菌落總數(shù)對數(shù)已達(dá)（6.25±0.01）CFU/g，超過了規(guī)定的可食用限量標(biāo)準(zhǔn)6 CFU/g；而復(fù)合保鮮劑組青魚的菌落總數(shù)增長速率明顯減慢，貯藏至第14天時菌落總數(shù)對數(shù)為（6.08±0.01）CFU/g，剛超過限量標(biāo)準(zhǔn)值。由此可知，4℃貯藏條件下，復(fù)合保鮮劑組處理組可使青魚片貨架期由6 d～8 d延長至12 d～14 d。竹葉抗氧化物和殼聚糖復(fù)合保鮮劑殺菌機(jī)理可能是其具有協(xié)同抑菌作用，可使細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白質(zhì)發(fā)生變性而起到了殺菌作用[20-21]。

3 結(jié)論

本文以青魚片為研究對象，探究了在4℃低溫貯藏條件下，竹葉抗氧化物與殼聚糖復(fù)合保鮮劑對青魚片貯藏品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：竹葉抗氧化物與殼聚糖復(fù)合保鮮劑具有較好的保鮮效果，3 g/L竹葉抗氧化物與15 g/L殼聚糖為最佳配比。在經(jīng)最佳復(fù)合保鮮劑處理后，其菌落總數(shù)、TVB-N、TBA、K值均明顯低于未經(jīng)保鮮劑處理的對照組，而感官評分高于對照組，貨架期可由6 d～8 d延長至12 d～14 d。本研究對青魚品質(zhì)控制、保鮮加工具有一定的參考價值。