基于HSP70下調(diào)表達的凋亡素衍生肽抑制GBM侵襲與生長的實驗研究

文 程，王 薇

（1.大慶醫(yī)學高等?？茖W校，黑龍江 大慶 163312；2.大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163111）

膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤,在膠質(zhì)瘤中約占50%[1]，其呈浸潤性生長，具有高復發(fā)率、高死亡率的特點。手術(shù)很難完全切除，且對化、放療具有明顯的抵抗性。GBM 患者經(jīng)過治療后的平均生存時間僅為14.6個月[2]，因此迫切需要尋找新的有效治療膠質(zhì)瘤的藥物。

凋亡素（Apoptin）是來自雞貧血病毒的蛋白質(zhì)，已經(jīng)證實其具有誘導包括膠質(zhì)瘤細胞在內(nèi)的70多種腫瘤細胞凋亡，并且無化療耐藥性的特點，被視為“抗腫瘤明星分子”[3]。凋亡素通過下調(diào)HSP70促進腫瘤細胞凋亡和誘發(fā)有絲分裂災變[4]。但凋亡素是大分子蛋白質(zhì)，到體內(nèi)后可能會產(chǎn)生一定的免疫原性而導致一定的副反應，因此，試想如果對凋亡素的結(jié)構(gòu)進行改造，利用其發(fā)揮效應的序列構(gòu)建一分子多肽片段，即凋亡素衍生肽，可能會起到更好的抗腫瘤效果，而且極大減少其對機體免疫原性反應。

本研究在確定HSP70在膠質(zhì)瘤細胞中高表達的基礎(chǔ)上，通過蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用對凋亡素分子序列進行分析，構(gòu)建出凋亡素衍生肽（ADP），并證實ADP能夠通過下調(diào)HSP70的表達而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖和生長，并證明該凋亡素衍生肽的作用優(yōu)于凋亡素以及常規(guī)化療藥物，進而為進一步開發(fā)治療GBM的藥物，提供有力依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U87-MG和U251-MG，GEM患者標本，多肽，質(zhì)粒。

1.2 研究方法

1.2.1 通過對照實驗，利用Western印跡分析、免疫組化、RT-PCR技術(shù)證實HSP70在膠質(zhì)瘤組織和細胞中表達均高于正常組織細胞。

1.2.2 利用蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用確定的凋亡有效片段，構(gòu)建出了凋亡素衍生肽（ADP），并對其作用進行評估；利用分析軟件對ADP的3D結(jié)構(gòu)進行分析，證實該衍生肽片段與理論值一致。

1.2.3 通過對ADP與凋亡素、常規(guī)化療藥物導致GBM細胞凋亡的比照分析，證實ADP促進GBM細胞凋亡程度更大。

1.2.4 通過ADP治療組和未治療組的HSP70表達下調(diào)程度與細胞核凋亡程度的分析，證實了ADP可通過降低HSP70的表達誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 HSP70在GBM樣本和正常腦組織的表達情況的對照分析

Western-blotting分析結(jié)果顯示了GBM中HSP70的表達高出正常腦組織（NBT）的3倍（圖1）。免疫組化結(jié)果顯示HSP70表達在膠質(zhì)瘤中顯著增加（圖2）。qRT-PCR分析結(jié)果結(jié)果顯示HSP70在膠質(zhì)瘤組織中和GBM細胞中的表達與NBT相比顯著增加（圖3）。同時也由此得出，U87-MG和U251-MG能夠作為本研究中GMB細胞的合適模型。

圖1

圖2

圖3

2.2 凋亡素衍生肽（ADP）的設(shè)計與結(jié)構(gòu)分析

通過系列分析，篩選出凋亡素衍生肽有效序列，并構(gòu)建出ADP，并通過體外pull-down測定裂解物、免疫共沉淀分析與免疫熒光分析證實其與HSP70間的相互作用。結(jié)果表明ADP多肽可以有效降低HSP70在細胞中的表達。利用分析軟件對ADP的3D結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明其與理論值的一致。

2.3 驗證ADP通過降低HSP70表達誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡

比較ADP-未處理和ADP處理的293和U87 - MG細胞的核蛋白的凋亡程度，進行核凋亡分析。Western blotting和免疫細胞化學分析結(jié)果均表明HSP70被表達。從細胞核形態(tài)顯示ADP治療組導致的凋亡更為明顯，表明ADP具有強烈的誘導U-87細胞凋亡的能力。

3 結(jié)論與討論

本研究為進一步尋求確定最短的序列凋亡素可以促進HSP70下調(diào)，并模擬凋亡素的抑制活性，在對凋亡素序列分析的基礎(chǔ)上，除去了NES（氨基酸：97-105）結(jié)構(gòu)域并保留了NLS1和NLS2結(jié)構(gòu)域，由LRS連接，并在N上添加了一個TAT序列該肽的末端用作標簽，進而構(gòu)建出凋亡素衍生肽ADP。通過一系列實驗證明了ADP保留絕大多數(shù)抗腫瘤特異性靶標的凋亡素的功能，其抑制GBM細胞中的HSP70轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮的作用比凋亡素在促進腫瘤細胞中的作用更強。因此，研究結(jié)果表明合成凋亡肽衍生肽具有較好的抑制GMB生長和侵襲作用。此外，鑒于HSP70在正常細胞中幾乎不表達[5]，因此ADP似乎可以作為理想的藥物用于GMB的治療，由此為GBM的治療提供了一種新的思路。