鹽堿脅迫對流蘇幼苗的生理影響1)

韓麗霞 歐陽敦君 劉文靜 張鴿香

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

土壤鹽堿化在世界范圍內(nèi)分布廣泛，已成為全球環(huán)境問題[1]。我國鹽堿土總面積約0.991 3億hm2，主要分布在華北、東北、西北及沿海地區(qū)[2]，是造成全球土地退化和影響土壤高效利用的主要原因之一[3]。鹽堿脅迫會導(dǎo)致土壤滲透勢下降，離子平衡失調(diào)，從而影響植物對離子的吸收，抑制植物的生長發(fā)育[4]。目前為止，人們對于鹽堿脅迫的研究重點在農(nóng)業(yè)和草業(yè)方面，林木耐鹽堿研究所占的比例甚少[5]，或者主要研究單鹽和單堿對植物生長發(fā)育影響[6]。流蘇(Chionanthusretusus)為木犀科流蘇樹屬落葉小喬木或灌木，產(chǎn)于甘肅、陜西、山西、河北、河南以南至云南、四川、廣東、福建、臺灣[7]。開花時花密，花形秀麗，如白雪般綴滿枝頭，是良好的園林觀賞樹種?，F(xiàn)今國內(nèi)外對流蘇樹的研究多集中在繁殖技術(shù)[8-11]、抗逆性[12-18]、藥用價值[19]等方面。在抗鹽堿方面多集中于對不同鹽濃度下流蘇樹種子發(fā)芽率及流蘇樹抗鹽生理機理等方面。張建鋒等[15]利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(NaCl)∶w(NaCl+KCl)=1∶1對流蘇的種子分別做不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽分處理。該試驗結(jié)果表明,流蘇具有一定的耐鹽能力，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%鹽分下，發(fā)芽率均在80%以上；隨著鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，種子發(fā)芽率逐漸下降。姚琳等[16]、馮蕾等[17]、王鑫等[18]分別對流蘇樹的抗鹽生理機理進(jìn)行了研究，表明了流蘇具有一定的耐鹽力。從已有的植物抗鹽堿生理研究來看，以單鹽NaCl的研究頗多，本試驗用NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34種鹽混合，模擬自然界鹽堿地生態(tài)環(huán)境，探討了流蘇幼苗對混合鹽堿脅迫的生理響應(yīng)特性及機制，以期為植物耐鹽堿種質(zhì)資源提供參考，為流蘇樹向鹽堿地區(qū)的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2年生流蘇播種苗，于2016年3月份將未展葉的流蘇幼苗從苗床起出，栽植于18 cm×16 cm的黑色育苗袋中，栽培基質(zhì)由V(園土)∶V(珍珠巖)∶V(蛭石)∶V(營養(yǎng)土)=2∶2∶2∶1配置而成，每盆土壤質(zhì)量1.5 kg，栽植1株。土壤密度為1.37 g·cm-3，含水量為73.75%，pH值為6.97，全氮、全磷、全鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.06、0.92、0.71 g·kg-1。移栽后置于蔭棚，正常管理4個月。于2016年7月份，選擇生長健壯，長勢基本一致的小苗進(jìn)行試驗處理。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在南京林業(yè)大學(xué)園林實驗教學(xué)示范中心(118°49′E，32°30′N))內(nèi)進(jìn)行。將NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34類鹽按不同摩爾比混合，分成3個處理組(分別用A、B、C、表示)，每組內(nèi)又設(shè)4個處理，其混合總濃度分別為50、100、200、300 mmol·L-1，共模擬出12個混合鹽堿組合(表1)，另設(shè)置蒸餾水為對照組。共12個處理，每個處理選50株苗，重復(fù)3次。

A處理組代表輕度堿脅迫(pH<8.45)，B處理組代表中度堿脅迫(8.45≤pH<9.50)，C處理組代表重度堿脅迫(pH≥9.50)；總鹽濃度亦分為低鹽濃度(50、100 mmol·L-1)、中鹽濃度(200 mmol·L-1)、高鹽濃度(300 mmol·L-1)。

2016年7月1日將流蘇幼苗移入溫室中，適應(yīng)一個星期后進(jìn)行脅迫處理，每個處理選50株苗，重復(fù)3次，用1.5 L鹽溶液充分透灌，使植株完全處于脅迫狀態(tài)，并在種植袋下墊一個托盤，將滲出的溶液倒回袋中。為防止?jié)阐}過多幼苗出現(xiàn)的沖擊效應(yīng)，將處理鹽溶液3次澆灌。脅迫初始澆灌500 mL，之后的第14、28天各補500 mL。脅迫42 d后，采取功能葉片進(jìn)行指標(biāo)測定。

表1 各處理鹽濃度和pH值

1.3 試驗方法

鹽害癥狀調(diào)查：根據(jù)鹽堿脅迫對流蘇的傷害程度，參考王琪等[20]的評價體系，將流蘇的外部形態(tài)變化分為5個等級(表2)進(jìn)行評價分析。鹽害指數(shù)計算公式為：

表2 鹽堿脅迫下流蘇表型性狀的評價體系

生理指標(biāo)的測定：電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[21]測定；丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸TBA顯色法測定；可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用蒽酮比色法測定；脯氨酸質(zhì)量濃度采用酸性茚三酮顯色法測定；超氧物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定；葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用乙醇-丙酮混合液浸泡法測定[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Excel2010管理數(shù)據(jù)，繪制圖表，SPSS19.0進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流蘇鹽害癥狀調(diào)查

根據(jù)流蘇幼苗在鹽堿脅迫過程中的形態(tài)變化，將鹽害癥狀分等級進(jìn)行評價，得到鹽害指數(shù)，如表3所示。隨著鹽堿脅迫的加重，流蘇的外部形態(tài)表現(xiàn)為葉片脫落越來越嚴(yán)重，最后全部脫落，接近死亡。其中，在低鹽濃度(50、100 mmol·L-1)脅迫下，盡管pH值不斷增大，只有C處理組，流蘇鹽害癥狀超過了50%；而在輕度堿脅迫下，在中高鹽濃度(200、300 mmol·L-1)流蘇葉片鹽害指數(shù)均在90%以上，說明超過流蘇所能承受的耐鹽范圍，對植株造成不可逆的傷害，可以推測出高鹽濃度對流蘇生長影響更大。

表3 流蘇幼苗鹽害指數(shù)、存活率

如表3所示，從流蘇幼苗存活率來看，300 mmol·L-1時，所有堿性鹽處理組的流蘇幼苗死亡率大于50%，B、C處理組，死亡率均超過60%，說明高鹽分和高pH值對流蘇幼苗的損傷程度都很大。

2.2 鹽堿脅迫對流蘇幼苗葉片生理性狀的影響

2.2.1 鹽堿脅迫對流蘇幼苗葉片相對電導(dǎo)率的影響

如表4所示，隨著鹽堿脅迫加重，流蘇葉片相對電導(dǎo)率均呈增加趨勢，且顯著高于對照組。B、C處理組各濃度處理脅迫下的相對電導(dǎo)率均達(dá)到50%以上，說明鹽堿脅迫已經(jīng)超過了流蘇的半致死范圍；在300 mmol·L-1時，輕度堿性鹽處理組的流蘇相對電導(dǎo)率驟然增加，中度堿性鹽脅迫增幅較平緩。

2.2.2鹽堿脅迫對流蘇葉片丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的影響

如表4所示，隨著鹽堿脅迫的加重，流蘇葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度均呈整體增加趨勢，且高于或顯著高于對照。其中，A處理組在100 mmol·L-1時達(dá)到最大值，分別為對照組的7.01倍，隨后流蘇葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度下降，說明流蘇具有一定的抗鹽能力；C處理組在50 mmol·L-1達(dá)到最大值，分別為對照組的3.26倍，說明無論是高濃度鹽還是高pH值脅迫，對流蘇丙二醛質(zhì)量摩爾濃度影響嚴(yán)重。

2.2.3 鹽堿脅迫對流蘇葉片脯氨酸質(zhì)量濃度的影響

如表4所示，隨著鹽堿脅迫的加重，各處理組流蘇葉片脯氨酸整體呈增加趨勢，但期間有波動，流蘇葉片脯氨酸質(zhì)量濃度均高于或顯著高于對照。A、C處理組內(nèi)的流蘇葉片脯氨酸質(zhì)量濃度呈遞增趨勢，B處理組內(nèi)的流蘇葉片脯氨酸質(zhì)量濃度呈“M”形變化。其中，A組鹽濃度為100 mmol·L-1時流蘇脯氨酸質(zhì)量濃度稍有降低，仍顯著高于對照，說明流蘇適應(yīng)性增強，細(xì)胞滲透勢下降，細(xì)胞質(zhì)濃度降低，細(xì)胞有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)減少；B處理組內(nèi)在鹽濃度為50 mmol·L-1時達(dá)到最大值，比對照組增加了56.7%。

2.2.4 鹽堿脅迫對流蘇葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如表4所示，隨著鹽濃度的增大，所有處理組的葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體呈增加趨勢，期間有波動，均與對照組差異顯著。其中，A處理組在濃度200 mmol·L-1時顯著增加，C處理組當(dāng)鹽濃度為50～200 mmol·L-1時流蘇葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加平緩，為300 mmol·L-1時顯著增加。低鹽濃度(50、100 mmol·L-1)、中鹽濃度(200 mmol·L-1)、高鹽濃度(300 mmol·L-1)堿性鹽處理的流蘇葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨pH值的增大不斷積累，但高鹽濃度(300 mmol·L-1)時，A、B處理組流蘇葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍有減少，也許是高鹽濃度脅迫使過多的Na+貯存在葉部，導(dǎo)致分化糖的酶活性增大，以至儲存的糖分降解；推測高pH堿性鹽脅迫對流蘇的抑制作用更大。

2.2.5鹽堿脅迫對流蘇葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

如表4所示，各處理組在鹽濃度為50 mmol·L-1時，流蘇葉片SOD活性迅速增大，隨著鹽濃度的增大SOD活性趨勢不同。其中，A處理組，隨著鹽濃度的升高，流蘇葉片SOD活性呈“上升-下降-上升”的趨勢，鹽濃度為100 mmol·L-1時流蘇SOD活性低于對照，比對照減少了22.8%；其余均高于對照組，說明SOD起到了保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用。C處理組中，在中高鹽濃度顯著下降，說明鹽分脅迫對流蘇產(chǎn)生了一定傷害的作用。

表4 堿性鹽脅迫對流蘇幼苗各生理指標(biāo)的影響

2.2.6 鹽堿脅迫下流蘇葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

如表4所示，隨著鹽濃度增大，各處理組流蘇葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)“上升-下降”趨勢，均顯著高于對照組。其中，A、B、C處理組下，流蘇葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在鹽濃度為200、100、100 mmol·L-1時達(dá)到最大值，分別是對照組的7.06、5.03、6.11倍。300 mmol·L-1時，流蘇葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化隨pH值的升高而上升。

2.2.7 鹽堿脅迫下流蘇各指標(biāo)的相關(guān)性

如表5所示，不同鹽分和處理組(pH值)及二者間的交互效應(yīng)對相對電導(dǎo)率、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、脯氨酸質(zhì)量濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。其中，處理組(pH值)對丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、脯氨酸質(zhì)量濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響高于鹽濃度，而對其他指標(biāo)來說鹽分的效應(yīng)大于處理組(pH值)。

本研究在鹽堿脅迫42 d后，對測定的6個流蘇幼苗生理生化指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析。由表6可知，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度分別與相對電導(dǎo)率、脯氨酸質(zhì)量濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)；脯氨酸質(zhì)量濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與相對電導(dǎo)率、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、SOD活性呈極顯著正相關(guān)；葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與相對電導(dǎo)率、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、脯氨酸質(zhì)量濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性呈顯著正相關(guān)。用多個生理生化指標(biāo)對流蘇進(jìn)行抗鹽堿綜合評價，可以避免各指標(biāo)間所提供的信息出現(xiàn)重疊和疏漏。

表5 鹽濃度和pH值及其交互作用對流蘇不同脅變指標(biāo)的影響

表6 鹽堿脅迫下各指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

植物的外部形態(tài)對鹽堿脅迫較敏感，可作為判斷植物受鹽堿脅迫程度的指標(biāo)[23]。本試驗研究結(jié)果表明，流蘇在低濃度鹽脅迫下表型性狀變化較小，即使pH值增大，也只有少部分葉片脫落，而在中、高濃度鹽脅迫下，受害程度明顯增加，說明鹽濃度對流蘇外部形態(tài)的影響大于pH值，這與對2個芍藥的品種研究結(jié)果一致[20]。

前人研究，植物在遭受脅迫時，胞膜透性變大引發(fā)植物體內(nèi)代謝失調(diào)，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，對植物造成損傷，植物的耐鹽堿能力可以通過膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性判斷，健全的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和正常的功能決定其支配細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和離子正常進(jìn)出細(xì)胞[24]。鹽堿脅迫對植物葉片細(xì)胞膜的選擇透過性破壞，直接導(dǎo)致細(xì)胞中電解質(zhì)大量外滲，使得電導(dǎo)率增大[25]。如薛菲等[25]對胡枝子、李玉梅等[26]對牛疊肚的鹽堿脅迫研究表明，鹽堿脅迫使葉片相對電導(dǎo)率升高。本研究中，隨著鹽堿脅迫的加重，流蘇幼苗相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)出增加趨勢，并均顯著高于對照組。在300 mmol·L-1時，輕度堿性鹽處理組的流蘇幼苗相對電導(dǎo)率驟然增加，中高度堿性鹽脅迫增幅較平緩。初步表明，流蘇對鹽堿逆境具有一定的適應(yīng)性，但隨鹽堿脅迫高于某濃度時，相對電導(dǎo)率明顯增大，表明傷害加深。丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物，會使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到損傷，致使膜透性增大或功能喪失，使細(xì)胞內(nèi)的大部分水溶性物質(zhì)外滲，而外部的Na+大批進(jìn)入，致使細(xì)胞內(nèi)的離子失衡[27]。丙二醛質(zhì)量摩爾濃度越高，說明質(zhì)膜受損越重，本研究中，流蘇丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈整體增加趨勢，期間有波動，這與李玉梅等[26]的研究一致。有關(guān)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度下降，大概是流蘇有較強的抗氧化能力，能避免細(xì)胞膜受損害，而隨后的回升，才是細(xì)胞膜受害的癥狀。

滲透調(diào)節(jié)是植物増強抗性的重要方式，也是其減緩鹽堿脅迫的重要手段，脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[28]。本研究中，隨鹽堿脅迫的加重，流蘇通過增大脯氨酸質(zhì)量濃度以適應(yīng)鹽堿處理。處理結(jié)束后，各處理流蘇脯氨酸質(zhì)量濃度有所下降，但仍顯著高于對照，且同一處理組中，流蘇脯氨酸質(zhì)量濃度并沒有隨鹽分的增大而增多，而同一鹽濃度則隨pH值的升高而增大。說明鹽濃度對流蘇脯氨酸質(zhì)量濃度的影響較大，堿脅迫由于呈堿性，可能會中和部分脯氨酸，造成同一處理組，流蘇脯氨酸質(zhì)量濃度變化規(guī)律性不強，與絨毛白蠟的結(jié)果相一致[29]。本研究中，流蘇可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨鹽堿程度的加重整體呈上升趨勢。高鹽(300 mmol·L-1)脅迫的A、B組，流蘇葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍有減少，原因在于高鹽濃度時，過量的Na+被貯存在葉部，導(dǎo)致分解糖的酶活性大增，糖分快速分解，同金山繡線菊的研究結(jié)果相一致[30]。

植物體內(nèi)存在活性氧(ROS)消除系統(tǒng)，包括SOD、POD等，細(xì)胞正常代謝情況下，該系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)[31]。當(dāng)植物受到鹽脅迫時，活性氧大量產(chǎn)生，打破了活性氧代謝平衡，使誘導(dǎo)保護(hù)酶SOD等的活性大幅升高，從而加強了活性氧的清除[32]。但是在鹽堿脅迫條件下，常因物種、品種、脅迫類型、脅迫時間等因素的不同，抗氧化酶系統(tǒng)呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)特征。江萍等[33]研究桃葉衛(wèi)矛時發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)SOD活性均隨鹽分的增加而先升再降，其中SOD活性相對較高。陳俊[34]在研究混合鹽堿處理對堿地膚抗氧化酶活性影響時發(fā)現(xiàn)，SOD活性均增強；低鹽濃度下，SOD活性上升，高鹽濃度時下降，堿脅迫(pH值)對SOD活性起抑制作用。吳成龍等[35]研究堿性鹽對菊芋抗氧化作用的影響時發(fā)現(xiàn)，SOD活性隨處理的加重而先升再降，且與丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，得出SOD在清除活性氧方面占主要地位。本研究中，各處理組在50 mmol·L-1濃度時，流蘇葉片SOD活性迅速增大，隨著鹽濃度的增大SOD活性趨勢不同。說明低濃度鹽堿脅迫條件下，流蘇葉片可通過自身調(diào)節(jié)機制，誘導(dǎo)增強SOD活性來保護(hù)細(xì)胞膜免受傷害，而鹽堿脅迫程度超出自身調(diào)節(jié)能力后，其SOD活性則不同程度地降低，說明流蘇保護(hù)酶系統(tǒng)的平衡被打破，這與前人的研究結(jié)果相一致[29]。

鹽堿處理有利于葉綠素酶的活性增強，致使葉綠素分解，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨脅迫的加重而降低[36]。本研究中，流蘇葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)大致隨鹽堿處理的加重先增后降。在低鹽、輕度堿處理時，流蘇葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照，隨著鹽分、pH值的增大，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速減少，說明低鹽分輕度堿性鹽有助于流蘇葉綠素的合成，高鹽高堿抑制葉綠素的合成，與前人研究結(jié)果一致[20，30]。在低鹽(50、100 mmol·L-1)輕度堿(A處理組)脅迫下，流蘇葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照，低鹽時，流蘇葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升，隨著鹽分、pH值的增加，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速減少，說明低鹽、低堿有助于流蘇葉綠素的產(chǎn)生，高鹽高堿抑制葉綠素的生成。

混合鹽堿脅迫并不是鹽、堿兩種脅迫的簡單疊加，而是有一定協(xié)同效應(yīng)[32]。在本研究中，在低鹽濃度(50、100 mmol·L-1)時，pH值雖然增大，但葉片鹽害癥狀、相對電導(dǎo)率、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化均不明顯，說明單純堿脅迫作用?。辉谳p堿濃度時(A處理組)，隨著鹽濃度的增大，流蘇葉片脯氨酸質(zhì)量濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化幅度不大，說明單純鹽脅迫作用也較小。當(dāng)鹽堿共同脅迫時，鹽害癥狀B、C處理在200、300 mmol·L-1的鹽害癥狀為100%，說明鹽與堿的協(xié)同效應(yīng)會對植物造成更大的傷害。

綜上研究表明，流蘇在低鹽輕堿條件下可以良好生長，在中鹽(200 mmol·L-1)、pH≥8.45會對流蘇造成較大影響。且鹽濃度和處理組(pH值)以及二者的交互效應(yīng)對各生理指標(biāo)均達(dá)到顯著水平，鹽與堿的協(xié)同作用使脅迫產(chǎn)生疊加效應(yīng),加重了危害的程度。