• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乙肝病毒血清標(biāo)志物與其DNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析及臨床意義

    2015-02-24 03:51:35
    關(guān)鍵詞:乙肝患者乙肝病毒乙肝

    馮 佳

    四川省南充市中心醫(yī)院 637000

    乙肝病毒血清標(biāo)志物與其DNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析及臨床意義

    馮佳

    四川省南充市中心醫(yī)院637000

    摘要目的:比較乙肝血清不同模式標(biāo)志物與HBV-DNA結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,探討二者之間的關(guān)系及臨床意義。方法:收集2012年8月-2013年3月乙肝患者標(biāo)本548例,采用酶聯(lián)免疫方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)乙肝病毒血清標(biāo)記物和病毒DNA,比較它們之間的關(guān)系。結(jié)果:HBsAg陽(yáng)性組共514例,HBV-DNA定量小于1×103copies/L(陰性)共244例,HBV-DNA定量大于1×103copies/L(陽(yáng)性)共270例,HBV-DNA對(duì)數(shù)值為(5.31±1.74);HBsAg、HBeAg、HBcAb陽(yáng)性組共118例,HBV-DNA對(duì)數(shù)值為(7.03±1.01);HBsAg、HBeAb、HBcAb陽(yáng)性組共260例,HBV-DNA定量陽(yáng)性共111例,其對(duì)數(shù)值為(4.21±1.20),HBV-DNA定量陰性共149例;HBsAg、HBcAb陽(yáng)性組共116例,HBV-DNA定量陰性共70例,HBV-DNA定量陽(yáng)性共46例,其對(duì)數(shù)值為(4.90±1.66);其他標(biāo)志物模式組共34例,HBV-DNA定量陰性。HBV-DNA對(duì)數(shù)值在HBeAg陽(yáng)性組與HBeAb陽(yáng)性組間相比,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Real-time PCR法和ELISA法診斷乙肝的敏感性分別為49.3%和93.8%,符合率為55.5%。結(jié)論:Real-time PCR法和ELISA法在HBeAg陽(yáng)性組有良好的相關(guān)性,兩種方法分別檢測(cè)乙肝病毒感染機(jī)體不同狀態(tài),它們之間能互為補(bǔ)充,不能相互替代。

    關(guān)鍵詞乙肝標(biāo)志物HBV-DNA酶聯(lián)免疫反應(yīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR

    Comparison and Clinical Significance of Quantitative Fluorescent Detection of HBV-DNA and the Results of Serum Marker

    FENG Jia.NanchongCentralHospital,NanchongCity,SichuanProvince637000

    ABSTRACT Objective:To compare the results of quantitative fluorescent detection of HBV-DNA with the HBV serum marker and explore the relationship and clinical significance.Methods:548 serum samples of HBV patients were collected from August 2012 to March 2013,all samples were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction(Real-time PCR)at the same time,then the results of serum markers of hepatitis B virus and viral DNA were analyzed.Results:There were 514 patients in the group of HBsAg(+),the positive patients of HBV-DNA in the group of HBsAg(+)were 270 and the average logarithmic value was(5.31±1.74).The patients in the group of HBsAg(+), HBeAg(+), HBcAb(+)were 118 and the positive patients of HBV-DNA were 118,the average logarithmic value was(7.03±1.01).The patients in the group of HBsAg(+), HBeAb(+), HBcAb(+)were 260 and the positive patients of HBV-DNA were 111,the average logarithmic value was(4.21±1.20).The patients in the group of HBsAg(+),HBcAb(+)were 116 and the positive patients were 46,the average logarithmic value was(4.90±1.66).The patients of the other group were 34 and the quantitative detection of HBV-DNA was negative. The diagnostic sensitivity of Real-time PCR and ELISA was 49.3% and 93.8% respectively, the coincidence rate of those two methods was 55.5%.Conclusion:There is a good correlation between Real-time PCR and ELISA,and the results of HBV patients detected by those two methods reflect the different states of hepatitis B infection.These two methods can complement each other and not substitute for each other.

    KEY WORDS HBV marker,HBV-DNA,ELISA,Real-time PCR

    乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是一個(gè)全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)道,全球60億人口中,約20億人曾感染過(guò)HBV,其中4.0億人為慢性HBV感染,每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌[1]。因此,乙肝病毒檢測(cè)對(duì)乙肝的診斷、治療和預(yù)后極為重要。隨著免疫學(xué)和分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展,檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物的方法不斷更新。目前臨床使用的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和分子診斷技術(shù)中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。本文對(duì)548例乙肝患者的乙肝免疫學(xué)標(biāo)志物與HBV-DNA定量的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析,探討二者之間的關(guān)系及臨床意義。

    1資料和方法

    1.1病例資料548例乙肝患者均來(lái)自2012年8月-2013年3月來(lái)我院就診的門(mén)診及住院乙肝患者,病程超過(guò)1年以上,其中男373例,女175例,年齡最大86歲,最小6歲,平均年齡(37.6±16.6)歲。乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)按《乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS299-2008)》執(zhí)行。

    1.2儀器與試劑HBV-DNA檢測(cè)系統(tǒng)包含實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒、校準(zhǔn)品、操作程序、數(shù)據(jù)處理軟件來(lái)自于上??迫A生物工程股份有限公司,質(zhì)控品為本實(shí)驗(yàn)室按文獻(xiàn)方法自制[2,3];酶聯(lián)免疫檢測(cè)系統(tǒng)包含酶標(biāo)儀、乙型肝炎病毒診斷試劑盒(五項(xiàng))、洗板機(jī)、操作程序、數(shù)據(jù)處理軟件來(lái)自于上??迫A生物工程股份有限公司,質(zhì)控品為衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。所有的儀器和檢測(cè)項(xiàng)目操作均按本室制定SOP文件執(zhí)行,所有檢測(cè)項(xiàng)目室內(nèi)質(zhì)控在控。

    1.3方法血清標(biāo)本的采集與處理:HBV-DNA標(biāo)本采集采用滅菌的一次性真空帶蓋塑料管,清晨空腹抽取靜脈血3~5ml,離心分離血清分裝于1.5ml滅菌EP管,保存于-20℃冰箱備用,1周內(nèi)完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR;HBV血清標(biāo)志物標(biāo)本采集采用一次性真空帶蓋塑料管,清晨空腹抽取靜脈血3~5ml,離心分離血清后當(dāng)天完成ELISA檢測(cè)。

    1.4數(shù)據(jù)處理HBV-DNA定量以大于1×103copies/L為判斷陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn),小于1×103copies/L為陰性;ELISA方法cut off值按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)設(shè)置并驗(yàn)證。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式,結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)。

    2結(jié)果

    2.1HBV感染血清標(biāo)志物主要組合模式與HBV-DNA定量陽(yáng)性結(jié)果的比較見(jiàn)表1。A組表示HBsAg、HBeAg、HBcAb陽(yáng)性組;B組表示HBsAg、HBeAb、HBcAb陽(yáng)性組;C組表示HBsAg、HBcAb陽(yáng)性組;D組表示HBsAg陰性(其他標(biāo)志物陽(yáng)性)組;E組表示HBsAg陽(yáng)性組(其他標(biāo)志物可能陽(yáng)性)

    表1 HBV感染血清標(biāo)志物主要組合模式與

    注:*:表示A組與B組比較;△表示A組與C組比較;#表示A組與E組比較。

    2.2548例乙肝患者以HBsAg陽(yáng)性和陰性進(jìn)行分組,分析兩種檢測(cè)方法的符合率和敏感性,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

    表2 兩種方法診斷乙肝患者的符合率和敏感性比較

    3討論

    乙肝病毒血清標(biāo)志物是目前診斷乙型肝炎最常用的指標(biāo),包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb五項(xiàng)指標(biāo),主要反映人體對(duì)乙肝病毒的免疫反應(yīng)狀態(tài)。檢測(cè)乙肝血清標(biāo)志物的免疫學(xué)方法中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA),該法靈敏度較高,可達(dá)到納克水平,如引入生物素和親和素系統(tǒng)或采用化學(xué)發(fā)光等技術(shù),其靈敏度還可進(jìn)一步提高。不同血清免疫學(xué)標(biāo)志物代表不同的臨床意義,如HBsAg是乙肝病毒感染的特異性標(biāo)志,陽(yáng)性常見(jiàn)于急性乙肝的潛伏期、急性期及慢性乙肝病毒感染狀態(tài)。HBeAg其陽(yáng)性和滴度可反映乙肝病毒的復(fù)制情況及傳染性的強(qiáng)弱等。

    實(shí)時(shí)定量PCR是目前臨床檢測(cè)HBV-DNA的分子生物學(xué)方法,既保持了PCR技術(shù)靈敏與快速的特點(diǎn),又克服了以往傳統(tǒng)PCR的假陽(yáng)性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn),其重復(fù)性好但檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜而且費(fèi)用較高。HBV-DNA陽(yáng)性代表有完整的乙肝病毒顆粒的復(fù)制,被認(rèn)為是衡量乙肝病毒復(fù)制有無(wú)及高低最靈敏、最精確與最直接的證據(jù)。

    本文在兩種方法同時(shí)檢測(cè)乙肝患者血清發(fā)現(xiàn)(表1),HBV-DNA在HBV血清學(xué)標(biāo)志物陽(yáng)性的各種模式中的檢出率不一樣,HBeAg陽(yáng)性組(A組)HBV-DNA檢出率為100%,其HBV-DNA平均含量約為107copies/ml,平均水平對(duì)數(shù)值為7.03;HBeAg陰性組(HBsAg陽(yáng)性,B、C組)HBV-DNA檢出率為41.8%,其HBV-DNA平均含量約為2.63×104copies/ml,平均水平對(duì)數(shù)值為4.42;與HBeAg陽(yáng)性組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。這組數(shù)據(jù)表明,HBeAg陽(yáng)性組患者體內(nèi)存在HBV病毒復(fù)制,有大量的病毒顆粒釋放入外周血中;HBeAg陰性組(HBsAg陽(yáng)性,B、C組)通常HBeAg 向HBeAb 的轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是肝細(xì)胞中活躍復(fù)制病毒的清除期, 但仍能檢出HBV-DNA ,這可能是編碼HBeAg所在C區(qū)因發(fā)生突變時(shí)HBeAg 不能表達(dá), 而HBV-DNA 不斷復(fù)制的結(jié)果[4],可表現(xiàn)為HBeAg陰性,但HBV-DNA為陽(yáng)性。用定量PCR 技術(shù)檢測(cè)慢性乙肝患者血清HBV-DNA含量表明: HBeAb 出現(xiàn)并不能表示HBV 復(fù)制的停止, 而只是復(fù)制水平的降低。 因此, 對(duì)HBeAb 陽(yáng)性, DNA 也陽(yáng)性者要慎重對(duì)待,這些乙肝病毒變異株與重型肝炎或肝炎慢性惡化有著極大關(guān)聯(lián)。同時(shí)有研究表明研究證實(shí),亞洲人平均50%的HBeAg陰性的慢性乙肝患者存在前C區(qū)突變[5],即前C區(qū)G1896 A變異,導(dǎo)致終止密碼子TAG改變,不能編碼HBeAg;C區(qū)啟動(dòng)子A1762 T和G1764 A的雙變異,前C區(qū)mRNA的產(chǎn)生減少,使HBeAg分泌減少。因此單以HBeAg作為乙肝病毒復(fù)制活躍與否的指標(biāo)是不夠的[5]。此外,兩種方法在診斷乙肝的敏感性也存在較大差異,ELISA方法的特異性是93.8%,而FQ-PCR診斷乙肝的敏感性為49.3%,二者的符合率55.5%。這主要是因?yàn)镕Q-PCR主要是通過(guò)檢測(cè)HBV病毒DNA,準(zhǔn)確地反映體內(nèi)病毒的復(fù)制情況,對(duì)乙肝治療方案的選擇和療效觀察有較大的指導(dǎo)意義,而ELISA方法檢測(cè)血清標(biāo)志物主要是反映患者感染乙肝后免疫學(xué)狀態(tài),由于受到基因突變、免疫耐受及方法學(xué)檢測(cè)敏感性等方面的影響,它還不能完全反映病毒顆粒在體內(nèi)的復(fù)制情況,除非增加新的血清標(biāo)志物,如前S1抗原等[6]。此外,在本次實(shí)驗(yàn)中亦出現(xiàn)乙肝五項(xiàng)標(biāo)志物全部陰性者27例, PCR 方法檢出2例DNA( + ) , 陽(yáng)性率為7.4%, 這是由于HBV-DNA 的出現(xiàn)早于其他血清學(xué)指標(biāo)[7], 受檢者可能處于感染早期。

    傳統(tǒng)乙肝血清標(biāo)志物由于其價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、診斷乙肝的敏感性較高等特點(diǎn),臨床上把它作為我國(guó)實(shí)驗(yàn)室乙肝檢測(cè)與篩查時(shí)的主要選擇指標(biāo)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的臨床應(yīng)用使乙肝病毒的量化上了一個(gè)新的臺(tái)階,雖然其存在檢測(cè)費(fèi)用較高、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室尚不能普及規(guī)范檢測(cè)等缺點(diǎn),但許多資料表明,只要有HBV-DNA 就可以引起HBV感染 , 這不僅有診斷意義, 而且也有流行病學(xué)意義。其在臨床治療方案選擇和藥物療效評(píng)價(jià)上也有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。因此,這兩種方法不能相互取代,可聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乙肝臨床診斷、治療方案評(píng)估及療效觀察提供較客觀的臨床意義。

    參考文獻(xiàn)

    [1]劉友德.山東地區(qū)HBeAg陰性慢性乙肝和肝硬化構(gòu)成比和抗病毒治療狀況的變遷及病毒基因型分析〔D〕.濟(jì)南:山東大學(xué),2008.

    [2]曹季軍,呂心路,許愛(ài)萍,等.乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)臨界室內(nèi)質(zhì)控品的制備與初步應(yīng)用〔J〕.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,22(8):2271-2273.

    [3]楊繼明.乙肝抗原、抗體免疫測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控品的制備及使用〔J〕.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,27(2):201-202.

    [4]王愛(ài)蓮,周永興,姚志強(qiáng),等. 乙型肝炎病毒前C區(qū)基因變異的研究〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志,1994,74(1): 64-65.

    [5]Funk ML,Rosenberg DM,etal.World-wide epidemiology of HBeAg-negative chronic hepatitis B and associated precore and core promoter variants〔J〕.J Viral Hepat,2002,9(1):52.

    [6]李琴,孫桂珍,魏玉香,等.Pre-S1蛋白與乙肝病毒DNA 和e抗原在診斷乙肝病毒復(fù)制時(shí)的對(duì)比性研究〔J〕.中華肝臟病雜志,2004,12(3):134-136

    [7]王平忠,周永興.HBV-DNA與HBV-M檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,1999,13(4):344.

    (編輯羽飛)

    收稿日期2014-09-04

    中圖分類(lèi)號(hào):R446;R512.6+2

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1001-7585(2015)03-0298-03

    猜你喜歡
    乙肝患者乙肝病毒乙肝
    乙肝知多少?——帶您走出乙肝誤區(qū)!
    肝博士(2024年1期)2024-03-12 08:38:56
    乙肝患者早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療、早獲益
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:16
    乙肝病毒感染在婦科惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展
    乙肝病毒攜帶者需要抗病毒治療嗎?
    胡蝶飛:面對(duì)乙肝病毒,乙肝感染育齡期女性該怎么做?
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:02
    乙肝患者的中西藥糾結(jié)
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:38
    乙肝媽媽:我該如何孕育一個(gè)健康寶寶?
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:32
    六個(gè)就診誤區(qū) 讓乙肝患者“二次受傷”
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:28
    選擇一線抗乙肝病毒藥物治療的重要性及必要性
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:26
    我哥這10年的悲歡離合乙肝路
    肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:49
    1024视频免费在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲第一av免费看| 国产精品99久久99久久久不卡| 人人澡人人妻人| 青草久久国产| 国产三级黄色录像| 久久人人97超碰香蕉20202| 91九色精品人成在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 成人国产av品久久久| 亚洲国产av新网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久天堂一区二区三区四区| 久久狼人影院| 91成人精品电影| 黄色成人免费大全| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 婷婷丁香在线五月| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久中文字幕一级| 少妇精品久久久久久久| 国产精品免费视频内射| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一级片'在线观看视频| 女警被强在线播放| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲,欧美精品.| 久久久久久久国产电影| 岛国在线观看网站| 两个人看的免费小视频| 一本色道久久久久久精品综合| 十八禁人妻一区二区| 黄色视频不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久精品人妻al黑| 十八禁网站免费在线| 老司机靠b影院| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲专区中文字幕在线| a级毛片黄视频| 丝袜美足系列| 中文字幕高清在线视频| 搡老乐熟女国产| 操美女的视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 男女边摸边吃奶| 天天添夜夜摸| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲,欧美精品.| 啦啦啦免费观看视频1| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 搡老乐熟女国产| 欧美大码av| 国产激情久久老熟女| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久精品成人免费网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品人妻1区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 男男h啪啪无遮挡| 久久久精品94久久精品| 国产一区二区在线观看av| 免费看十八禁软件| 51午夜福利影视在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产在线观看jvid| 少妇粗大呻吟视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久人人爽av亚洲精品天堂| 少妇的丰满在线观看| 99热国产这里只有精品6| 视频区图区小说| 国产精品一区二区在线观看99| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 大片电影免费在线观看免费| 欧美日韩福利视频一区二区| 一级片免费观看大全| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久久精品人妻al黑| 久久天堂一区二区三区四区| 色在线成人网| 日韩中文字幕欧美一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久久精品国产欧美久久久| 99热国产这里只有精品6| 久久精品亚洲av国产电影网| 交换朋友夫妻互换小说| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲av美国av| 成年动漫av网址| 免费看a级黄色片| 丝袜在线中文字幕| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 不卡av一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| www.熟女人妻精品国产| 成人影院久久| 婷婷丁香在线五月| 欧美一级毛片孕妇| 一本色道久久久久久精品综合| 国产单亲对白刺激| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 热99re8久久精品国产| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本wwww免费看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美日韩成人在线一区二区| 极品教师在线免费播放| 精品视频人人做人人爽| av天堂在线播放| 91精品国产国语对白视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久影院123| 国产1区2区3区精品| 欧美激情高清一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 精品亚洲成国产av| 丝袜喷水一区| 男女午夜视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 黄色 视频免费看| 999精品在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲 国产 在线| 嫩草影视91久久| 日本五十路高清| 亚洲伊人色综图| www.自偷自拍.com| 蜜桃国产av成人99| 美女午夜性视频免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 人妻一区二区av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久久精品人妻al黑| 女性生殖器流出的白浆| 露出奶头的视频| 欧美激情高清一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久99一区二区三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 夜夜爽天天搞| 亚洲人成电影观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久九九热精品免费| 制服诱惑二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜激情久久久久久久| 亚洲情色 制服丝袜| 久久99热这里只频精品6学生| 精品高清国产在线一区| 美国免费a级毛片| 色老头精品视频在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲成人免费av在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 视频区欧美日本亚洲| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久精品成人免费网站| 亚洲精华国产精华精| 久久久久国内视频| 欧美乱妇无乱码| 国产国语露脸激情在线看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久视频综合| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 午夜激情久久久久久久| 亚洲欧洲日产国产| www.熟女人妻精品国产| 精品第一国产精品| av电影中文网址| 一二三四在线观看免费中文在| 蜜桃国产av成人99| 一个人免费看片子| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一夜夜www| 超色免费av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产单亲对白刺激| 黑人猛操日本美女一级片| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜激情av网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 色在线成人网| 老汉色av国产亚洲站长工具| 视频区图区小说| netflix在线观看网站| 在线观看一区二区三区激情| 欧美精品一区二区大全| 久久久精品94久久精品| 一级黄色大片毛片| 人妻一区二区av| 日韩有码中文字幕| 国产精品电影一区二区三区 | 成年人午夜在线观看视频| 亚洲 国产 在线| 精品人妻在线不人妻| 国产成人精品无人区| 热99re8久久精品国产| av电影中文网址| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产成人精品在线电影| 波多野结衣一区麻豆| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产男靠女视频免费网站| 亚洲中文av在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲熟女毛片儿| 蜜桃在线观看..| 18禁美女被吸乳视频| 女警被强在线播放| 国产精品一区二区在线不卡| 9热在线视频观看99| 精品人妻1区二区| www.999成人在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产成人欧美在线观看 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 岛国在线观看网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲美女黄片视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄色视频,在线免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 正在播放国产对白刺激| 咕卡用的链子| 亚洲成人免费电影在线观看| 男女午夜视频在线观看| 亚洲久久久国产精品| 天天添夜夜摸| 麻豆av在线久日| 操美女的视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 99九九在线精品视频| 一级黄色大片毛片| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品乱久久久久久| 一级毛片女人18水好多| 欧美激情久久久久久爽电影 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲久久久国产精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜老司机福利片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜福利欧美成人| 国产av精品麻豆| aaaaa片日本免费| 成人精品一区二区免费| 在线观看www视频免费| 考比视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 国产欧美日韩一区二区精品| 免费av中文字幕在线| 一本久久精品| 亚洲全国av大片| 在线永久观看黄色视频| 亚洲七黄色美女视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 老熟妇乱子伦视频在线观看| tube8黄色片| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品秋霞免费鲁丝片| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品中文字幕在线视频| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产97色在线日韩免费| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品成人在线| 搡老乐熟女国产| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 五月开心婷婷网| 麻豆国产av国片精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产在线一区二区三区精| 成人免费观看视频高清| 操美女的视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 人妻 亚洲 视频| 夜夜爽天天搞| 国产亚洲欧美精品永久| av不卡在线播放| 亚洲美女黄片视频| 老司机影院毛片| av福利片在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩免费av在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久亚洲精品不卡| 黄片小视频在线播放| 91成年电影在线观看| 一区在线观看完整版| 欧美大码av| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲美女黄片视频| 国产精品一区二区在线观看99| 日本av免费视频播放| svipshipincom国产片| 黄色视频在线播放观看不卡| 日本五十路高清| 女人久久www免费人成看片| 一区二区三区精品91| 高清在线国产一区| 757午夜福利合集在线观看| videos熟女内射| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产精品一区二区精品视频观看| videos熟女内射| 黑丝袜美女国产一区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产av国产精品国产| 美女视频免费永久观看网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文字幕人妻熟女乱码| 99国产精品99久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产区一区二久久| 午夜福利影视在线免费观看| 搡老岳熟女国产| 久久99一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 亚洲一区中文字幕在线| 一区福利在线观看| 午夜福利在线观看吧| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 精品人妻在线不人妻| 嫁个100分男人电影在线观看| 两个人看的免费小视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲免费av在线视频| 老司机亚洲免费影院| 日本欧美视频一区| 极品教师在线免费播放| 免费在线观看黄色视频的| 久久 成人 亚洲| 另类精品久久| 人妻 亚洲 视频| 国产福利在线免费观看视频| 午夜激情久久久久久久| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 搡老岳熟女国产| 久久久久久久久久久久大奶| 伦理电影免费视频| 动漫黄色视频在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 后天国语完整版免费观看| 国产人伦9x9x在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产一区二区激情短视频| 日本一区二区免费在线视频| 黄色毛片三级朝国网站| 韩国精品一区二区三区| 18禁美女被吸乳视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品久久久久久电影网| 91九色精品人成在线观看| av线在线观看网站| 天天添夜夜摸| 首页视频小说图片口味搜索| 岛国在线观看网站| 欧美午夜高清在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一本综合久久免费| 岛国毛片在线播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久狼人影院| 国产极品粉嫩免费观看在线| 蜜桃国产av成人99| 高清黄色对白视频在线免费看| 看免费av毛片| 午夜福利一区二区在线看| 日本一区二区免费在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| www.熟女人妻精品国产| 少妇精品久久久久久久| 久久香蕉激情| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品一区二区在线观看99| 9色porny在线观看| 人妻 亚洲 视频| 女人精品久久久久毛片| 好男人电影高清在线观看| 香蕉国产在线看| 国产精品国产高清国产av | 国产不卡av网站在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产深夜福利视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 怎么达到女性高潮| 涩涩av久久男人的天堂| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美性长视频在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久久视频综合| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品亚洲成国产av| 嫁个100分男人电影在线观看| 午夜日韩欧美国产| 国产91精品成人一区二区三区 | 欧美精品亚洲一区二区| 男女床上黄色一级片免费看| 女警被强在线播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| a级片在线免费高清观看视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 人妻 亚洲 视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产麻豆69| 欧美日韩精品网址| 五月开心婷婷网| 色尼玛亚洲综合影院| 嫩草影视91久久| 桃红色精品国产亚洲av| 国产在视频线精品| 国产精品二区激情视频| 中文字幕色久视频| 中文字幕制服av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成人永久免费在线观看视频 | 国产成人欧美在线观看 | 激情在线观看视频在线高清 | 老司机影院毛片| 国产一区二区 视频在线| 日韩视频在线欧美| aaaaa片日本免费| 超碰97精品在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品人妻1区二区| 国产麻豆69| 老熟女久久久| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品影院久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| av天堂在线播放| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线观看人妻少妇| 中文字幕色久视频| 精品一区二区三卡| 午夜激情久久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 午夜激情久久久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日本五十路高清| 免费在线观看黄色视频的| 手机成人av网站| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲av片天天在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 精品午夜福利视频在线观看一区 | 另类亚洲欧美激情| aaaaa片日本免费| 欧美成人午夜精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩精品免费视频一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美久久黑人一区二区| 精品视频人人做人人爽| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 飞空精品影院首页| 1024视频免费在线观看| av不卡在线播放| 久久中文字幕一级| 窝窝影院91人妻| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 1024香蕉在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 日本五十路高清| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一级a爱视频在线免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品一区二区三区av网在线观看 | 天堂中文最新版在线下载| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | videosex国产| 黄片播放在线免费| 亚洲国产看品久久| 亚洲伊人久久精品综合| 老汉色∧v一级毛片| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 一二三四社区在线视频社区8| 国产男女内射视频| 亚洲美女黄片视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 满18在线观看网站| 精品久久久精品久久久| 岛国毛片在线播放| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 桃红色精品国产亚洲av| av免费在线观看网站| 男女免费视频国产| 精品久久久精品久久久| 大香蕉久久网| 午夜免费鲁丝| 日韩欧美三级三区| 黑人猛操日本美女一级片| 国产一区有黄有色的免费视频| 热99re8久久精品国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 中国美女看黄片| 麻豆成人av在线观看| 高清毛片免费观看视频网站 | 久久久久精品人妻al黑| 搡老乐熟女国产| 两个人免费观看高清视频| 大码成人一级视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲国产av影院在线观看| 18禁观看日本| av福利片在线| 999精品在线视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽 | 男女下面插进去视频免费观看| 无限看片的www在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| netflix在线观看网站| 视频区欧美日本亚洲| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日韩三级视频一区二区三区| 91大片在线观看| 亚洲精品一二三| 搡老乐熟女国产| 99精品欧美一区二区三区四区| 最新美女视频免费是黄的| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品一区二区在线不卡| 热99久久久久精品小说推荐| 黑人欧美特级aaaaaa片| 天堂动漫精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品二区激情视频| 91大片在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 久久午夜综合久久蜜桃| 热99久久久久精品小说推荐| 制服人妻中文乱码| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品一区二区在线不卡| 国产欧美日韩一区二区三| 夫妻午夜视频| 国产伦理片在线播放av一区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99精品在免费线老司机午夜| 国产免费现黄频在线看| 在线观看舔阴道视频| 国产福利在线免费观看视频| 午夜福利影视在线免费观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久中文字幕人妻熟女| 一本综合久久免费| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 交换朋友夫妻互换小说| 麻豆成人av在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久久国产电影| 国产区一区二久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人啪精品午夜网站| 人妻 亚洲 视频|