分子技術(shù)在糖尿病足感染病原體鑒定中的應(yīng)用進展

譚惠婷，安 敏，李青華，李柳然，張 樺

南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科，廣東廣州 510280

國際糖尿病聯(lián)盟最新數(shù)據(jù)顯示，2019 年因糖尿病或其并發(fā)癥死亡的人數(shù)約占全球全因死亡人數(shù)的11.3%[1]。其中，糖尿病足是重要原因之一。有學者估計，糖尿病患者中糖尿病足潰瘍的患病率高達19% ～ 34%[2]。糖尿病足潰瘍處理不當會發(fā)展為糖尿病足感染，15%的糖尿病足感染患者由于感染惡化最終不得不截肢[3]。因此對于糖尿病足患者來說，早期診治、避免感染惡化較為關(guān)鍵。感染控制不徹底主要歸咎于病原微生物鑒定的不足以及缺乏對微生物群落的全面認識。目前應(yīng)用于糖尿病足感染的病原體鑒定主要包括兩大類—培養(yǎng)法及分子技術(shù)。前者包括傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)及培養(yǎng)組學，后者主要包括16S rRNA 測序、宏基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序等。本文將對國內(nèi)外現(xiàn)有的糖尿病足感染病原體的鑒定技術(shù)進行總結(jié)，重點介紹相關(guān)分子技術(shù)及其在指導(dǎo)糖尿病足患者抗感染治療中的優(yōu)勢。

1 培養(yǎng)法

1.1 微生物培養(yǎng)法 微生物培養(yǎng)法在初步表征糖尿病足感染的微生物學信息中起到重要作用，此法具有低成本、操作簡易、技術(shù)成熟等優(yōu)點，是目前臨床上研究糖尿病足感染的主流方法。臨床研究顯示糖尿病足感染患者培養(yǎng)出的最常見致病菌是金黃色葡萄球菌[4-5]。一項納入126 名患者的研究共分離出134 種病原體，最常見的兩種菌依次是金黃色葡萄球菌(35%)、銅綠假單胞菌(15.6%)[6]；同時該研究還發(fā)現(xiàn)潰瘍的嚴重程度可能會影響培養(yǎng)的結(jié)果，隨著糖尿病足嚴重程度的增加，革蘭陰性細菌(尤其是糞腸球菌)的比例也增加。但微生物培養(yǎng)法在一些情況下容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果，如生長緩慢或培養(yǎng)條件苛刻的致病菌、厭氧菌以及在接受抗生素治療的患者中采樣等[7]。因此不一定能真實反映出糖尿病足感染的重要生物學信息或微生物種群的全貌。而且培養(yǎng)法耗時相對較長，阻礙了敏感抗生素的及時應(yīng)用，一定程度上影響患者有效治療。

1.2 培養(yǎng)組學 培養(yǎng)組學主要使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜以優(yōu)化培養(yǎng)條件，促進傳統(tǒng)培養(yǎng)法難以培養(yǎng)的病原體生長[8]。其通過細菌蛋白質(zhì)產(chǎn)生獨特的“質(zhì)譜指紋”來識別細菌的種屬[9]。一項關(guān)于培養(yǎng)組學的研究顯示，從43 例中重度糖尿病足患者中分離出的需氧菌主要為金黃色葡萄球菌(52.8%)、葡萄球菌(18.7%)、表皮葡萄球菌(11.3%)；厭氧菌主要為糞腸球菌(45.2%)、陰溝腸桿菌(22.6%)、奇異變形桿菌(11.3%)和大芬戈爾德菌(9.4%)，并且88.3%樣品是混合性感染。另外，金黃色葡萄球菌與傷口惡化相關(guān)，但傷口中某些凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌、沙門菌)與傷口愈合有關(guān)[10]?？梢娕囵B(yǎng)組學描繪相當豐富的細菌多樣性，并且加深我們對細菌與宿主之間的認識。但此法需要通過質(zhì)譜儀分析較大數(shù)量的新鮮菌落，存在工作量大和無法進行大樣本檢測的局限性。同時，由于無法識別尚未培養(yǎng)成功的微生物，從而造成一定的假陰性結(jié)果。更重要的是，培養(yǎng)組學不能像分子技術(shù)那樣直接提供有關(guān)基因表達和細菌潛在功能的數(shù)據(jù)[8]。

2 分子技術(shù)

2.1 16S rRNA 測序法 16S rRNA 基因在細菌進化過程中高度保守，該基因具有9 個高度可變的區(qū)域(V1 ～ V9)，不同細菌種群之間具有序列多樣性，因此可通過該序列鑒定細菌的特定屬或種[11-12]。根據(jù)序列的相似程度，通過計算機分析后分為可操作的分類單位(operational taxonomic unit，OTU)，OTU 相似性為97%或以上通常被認為屬于同一種屬水平[13]。

16S rRNA 測序法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，不僅檢出率更高，而且可測出更多細菌物種數(shù)量。Dowd等[14]的研究顯示，傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)在55%的患者中顯示有革蘭陽性細菌生長，16S rRNA 測序則為75%；而嗜胨菌屬、厭氧球菌屬以及棒狀桿菌屬只在16S rRNA 測序中分析出來。同樣，Gardner等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)法極大地低估了微生物負荷和潛在病原體的存在。此外，Banerjee 等[16]將培養(yǎng)法及PCR 法鑒定結(jié)果為陰性的10 個樣本以16S rRNA 測序再次鑒定，結(jié)果顯示其中6 個樣本存在變形桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬。國內(nèi)胡萍等[17]基于16S rRNA 測序分析糖尿病足骨髓炎感染的病原微生物，與培養(yǎng)法相比，16S rRNA 測序除了陽性檢出率較高、平均每個樣本病原菌數(shù)較多以外，革蘭陰性菌所占的比例也較高(67.16% vs 50.00%)，甚至檢測出不存在于培養(yǎng)法的菌屬13 種，其中11 種為專性厭氧菌或嚴格厭氧菌，證實16S rRNA 測序更為準確全面，尤其對革蘭陰性菌和厭氧菌有顯著的優(yōu)勢。在鑒定罕見細菌時16S rRNA 測序分析也顯示獨特的優(yōu)勢。通過16S rRNA 測序方法在糖尿病足中檢測到了食酸戴爾福特菌、嗜線蟲沙雷菌、唾液鏈球菌、核粒梭桿菌、琥珀酸桿菌、佩滕科費爾葡萄球菌等培養(yǎng)法較少培養(yǎng)出的菌種[18]。

不可忽略的是，16S rRNA 測序同樣存在一定的局限性。如基因的特定區(qū)域需要與相應(yīng)的引物結(jié)合以產(chǎn)生PCR 產(chǎn)物，因此引物的應(yīng)用不足也會導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。此外，相關(guān)性較高的物種之間，高度可變區(qū)的多樣性會降低，需要設(shè)計多個引物組來擴增不同高度可變區(qū)，以減少誤差。同時，由于此法是擴增所有DNA，因此無法區(qū)分存活和死亡病原體；人線粒體DNA 的污染也會造成假陽性結(jié)果[13]。而且，16S rRNA 測序僅限于測病原體基因組的單個區(qū)域，缺乏對糖尿病足感染機制的認識，如細菌的功能途徑、生物膜、毒力因子、抗菌藥敏感度等。

2.2 宏基因組測序法 宏基因組測序是利用非靶向測序來測定樣品中所有微生物的基因組，能夠彌補培養(yǎng)法和16S rRNA 測序法的不足[19-20]。這種新興的技術(shù)使微生物群落的潛在功能、種群之間的相互作用更加清晰，甚至對復(fù)雜傷口的遺傳潛力進行全局表征[21]。隨著測序通量的增加和測序成本的下降，宏基因組測序在臨床上嶄露頭角。

Kalan 等[22]利用宏基因組測序法對100 例無感染癥狀的糖尿病足潰瘍患者標本進行分析，在菌株水平方面研究樣本的微生物群落，并鑒定微生物的毒力和致病性。這項研究顯示，糖尿病足患者中最豐富的細菌為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、紋帶棒桿菌和糞便產(chǎn)堿桿菌，此外還有疏螺旋體屬、產(chǎn)酸克雷伯菌、不解糖卟啉單胞菌等少見菌種。

為了分析糖尿病足感染微生物組的基因功能，研究者通常利用SEED 數(shù)據(jù)庫(種子數(shù)據(jù)庫)預(yù)測微生物的作用途徑[23]。Kalan 等[22]的研究表明，較深且氧合不良的傷口與微生物高代謝密切相關(guān)，包括莢膜、細胞外多糖和糖酵解的產(chǎn)生等。創(chuàng)面的不愈合及嚴重程度與金黃色葡萄球菌菌株相關(guān)，且首次提出金黃色葡萄球菌7372 和金黃色葡萄球菌10757 菌株是糖尿病足潰瘍的優(yōu)勢菌株，基因組比對分析顯示，兩者以不同的噬菌體依賴性控制毒力相關(guān)的基因座。金黃色葡萄球菌7372 株還富含與免疫逃逸相關(guān)的不同毒力因子、擴散感染的葡萄球菌激酶、抑制人類免疫調(diào)節(jié)作用和吞噬作用的scn 基因等致病因子。然而，葡萄球菌腸毒素C-2、腸毒素A 則為金黃色葡萄球菌10757 株所獨有。正是基于基因組檢測出致病菌的多樣化導(dǎo)致不同的宿主反應(yīng)和臨床結(jié)果。

宏基因組測序雖能提供樣本中微生物群落基因的“全景圖”，但無法區(qū)分基因是表達還是沉默，因此可能會造成假陽性結(jié)果。另外，宏基因組測序產(chǎn)生巨大而復(fù)雜的數(shù)據(jù)庫，可多達數(shù)百Gb 的數(shù)據(jù)序列，而回收的DNA 序列是片段性的，因此在宏基因組測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA(ncRNA)和核糖開關(guān)相比在單個基因組中更加困難[24]。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序法 轉(zhuǎn)錄組測序法利用樣品中分離出的mRNA 挖掘群落中活性基因的多樣性及表達譜[25]。其能識別基因表達的生物特征，同時避免了微陣列的基因鑒定、交叉雜交、背景噪聲等缺點[26]。Leung 等[27]對感染肺炎克雷伯菌或銅綠假單胞菌的傷口進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，傷口周圍細胞特異性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的下調(diào)以及浸潤性白細胞特征轉(zhuǎn)錄物的上調(diào)可作為傷口愈合不良或傷口特異性治療的標志物。Karna 等[28]發(fā)現(xiàn)傷口從感染到愈合的過程中，不同類別ncRNA 的調(diào)節(jié)遵循連續(xù)且協(xié)調(diào)的模式。該研究評估了傷口在對抗銅綠假單胞菌感染時的轉(zhuǎn)錄組變化，在傷口接種細菌后的2 h，傷口邊緣下調(diào)的基因包括幾乎所有的ncRNA( 包括snoRNA，miRNA) 和RNU6 假基因，這些下調(diào)先于皮膚富集編碼基因表達的下調(diào)。但隨著感染的加劇，在下調(diào)的基因中，ncRNA 的表達仍然過多。感染5 d 和9 d 后，對照組ncRNA 數(shù)量減少，而仍存在感染或愈合欠佳的傷口，ncRNA數(shù)量增加。

值得注意的是，蛋白組學在病原體鑒定方面也能識別基因表達的生物特征。雖未見使用蛋白組學對糖尿病足病原體鑒定以及其致病機制的研究，但Klein 和Rianey 等[29-30]利用蛋白組學解釋口腔疾病中變形鏈球菌的致病機制，表明蛋白組學在研究病原體致病方面具有一定的潛力。目前，關(guān)于糖尿病足感染方面尚無將宏基因組測序與轉(zhuǎn)錄組測序或蛋白質(zhì)組學結(jié)合使用的研究報道。但Lassek 等[31]將宏基因組測序與蛋白質(zhì)組學結(jié)合起來，很好地分析生物膜相關(guān)的尿路感染致病機制。通過宏基因組測序進行群落分析，銅綠假單胞菌和摩根菌均被鑒定為主要微生物。蛋白質(zhì)組學分析隨后在功能水平上明確銅綠假單胞菌上調(diào)了參與紅細胞降解、鐵載體系統(tǒng)、生物膜、抗生素耐藥和致病性等的蛋白質(zhì)水平。另外，蛋白組學數(shù)據(jù)的質(zhì)量與宏基因組學分析的質(zhì)量密不可分。蛋白組學需要根據(jù)宏基因組學來預(yù)測蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫?？梢?，宏基因組發(fā)揮優(yōu)勢的同時，若結(jié)合其他分子技術(shù)(如轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學)研究糖尿病足感染，可能會達到事半功倍的效果。

3 基于分子技術(shù)對糖尿病足感染進行精準治療

目前糖尿病足的抗菌治療主要依賴藥敏試驗，一般采用細菌培養(yǎng)或基于PCR 的方法，但這兩者僅限于常見的細菌和抗生素，且采樣和運送過程也會極大地影響結(jié)果[18]。使用宏基因組學鑒定糖尿病足的病原體耐藥基因可以克服以上局限性，并提供有關(guān)耐藥的所有基因信息[32]。Kalan 等[22]進行的宏基因組測序研究表明，超過50%的樣本含有氨基糖苷、大環(huán)內(nèi)酯、β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素類的耐藥基因，其中金黃色葡萄球菌10757 菌株含有大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥基因，這可能解釋糖尿病足潰瘍中多耐藥病原體的增加。宏基因組測序僅表明存在編碼耐藥的基因，而轉(zhuǎn)錄組測序可以幫助我們了解耐藥基因的表達與否。Hall 等[33]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，鑒定了PA3225調(diào)控的基因產(chǎn)物(如ABC 轉(zhuǎn)運蛋白PA3228)，發(fā)現(xiàn)其可能與銅綠假單胞菌抗生素耐藥性有關(guān)。更重要的是這些分子技術(shù)可以幫助我們對新耐藥細菌在臨床出現(xiàn)之前進行預(yù)測。

歐洲傷口管理協(xié)會已禁止對未感染的傷口使用抗生素[34]。但臨床工作中，以防發(fā)生感染或促進傷口愈合，臨床醫(yī)生經(jīng)常對未感染的糖尿病足潰瘍患者也使用不同種類的抗生素。這無疑加劇了耐藥菌株甚至多耐藥的“超級細菌”的出現(xiàn)。Messad 等[35]通過基因組比對發(fā)現(xiàn)，含有ROSA 樣噬菌體的金黃色葡萄球菌菌株并無毒性，這可能解釋了該細菌在慢性糖尿病足傷口中的定殖能力以及它們與宿主的共生關(guān)系。該研究建議我們盡可能利用有效的方法檢測慢性傷口中是否存在增加或降低細菌毒力的噬菌體，以明確使用抗生素的必要性。

4 結(jié)語

分子技術(shù)讓我們對糖尿病足感染的微生態(tài)也有了更廣闊的認識，尤其是罕見的、培養(yǎng)條件苛刻的病原體。然而，目前國內(nèi)分子技術(shù)在糖尿病足感染中的應(yīng)用較少，有以下幾個客觀原因：1)相比傳統(tǒng)培養(yǎng)法花費高；2)測序技術(shù)要求高；3)對測序結(jié)果的解讀需要較強的專業(yè)知識；4)目前數(shù)據(jù)庫仍需進一步完善。另外也存在一定的主觀因素：我們對分子技術(shù)的認識不夠深入，僅將分子技術(shù)作為一種科研工具。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和測序成本的下降，臨床醫(yī)生認識微生物的方法不能局限于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，應(yīng)合理利用分子技術(shù)進行更多、更完善的系統(tǒng)性臨床研究，為梳理糖尿病足宿主與病原體錯綜復(fù)雜的關(guān)系、發(fā)現(xiàn)更有效的抗感染方法等提供更全面可靠的依據(jù)。