西地那非對高糖培養(yǎng)施旺細(xì)胞保護(hù)作用的機制研究

黃歡捷 王訊 程一帆 鄧斌斌 黃崇礎(chǔ) 張萬里

[摘要] 目的 探討西地那非對高糖培養(yǎng)施旺細(xì)胞保護(hù)作用的研究。 方法 培養(yǎng)并純化后的大鼠施旺細(xì)胞為研究對象，分為正常對照組、高糖組、滲透壓對照組 、高糖加不同濃度西地那非組 。CCK-8法檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞活性氧（ROS），Tunnel法檢測細(xì)胞凋亡率，Western blot 法檢測細(xì)胞Nrf-2的表達(dá)。 結(jié)果 高糖組施旺細(xì)胞內(nèi)Nrf-2蛋白表達(dá)降低[高糖組（0.33±0.04），正常對照組（1.00±0.05）]，ROS水平增高[高糖組（50.61±6.75），正常對照組（23.44±4.18）]，細(xì)胞凋亡率升高[高糖組（36.62±3.15），正常對照組（4.53±0.26）]，細(xì)胞活性下降[高糖組（0.91±0.17），正常對照組（1.65±0.25）]。不同西地那非能上調(diào)高糖培養(yǎng)施旺細(xì)胞內(nèi)Nrf-2 蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性。 結(jié)論 西地那非可能通過激活Nrf-2信號通路誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激保護(hù)高糖環(huán)境下的施旺細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞] 高糖;西地那非;施旺細(xì)胞;氧化應(yīng)激

[中圖分類號] R587.2;R747.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）18-0028-04

A study of the mechanism of sildenafil's protective effect on Schwann cells cultured in high glucose

HUANG Huanjie1 ? WANG Xun1 ? CHENG Yifan1 ? DENG Binbin1 ? HUANG Chongchu2 ? ZHANG Wanli1

1.Department of Neurology， Division Ⅰ， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325015， China; 2.Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325015， China

[Abstract] Objective To investigate the study of sildenafil's protective effect on Schwann cells cultured in high glucose. Methods The cultured and purified Schwann cells of rats were taken as research subjects and divided into the normal control group， the high glucose group， the osmotic pressure control group and the high glucose plus different concentrations of sildenafil group. CCK-8 method was used to detect the cell activity， flow cytometric method was used to detect reactive oxygen species（ROS） of the cells， Tunnel method was used to detect the apoptosis rate of the cells， and Western blot method was used to detect the Nrf-2 expression of the cells. Results The protein expression of Nrf-2 in Schwann cells in the high glucose group decreased[（0.33±0.04） in the high glucose group， （1.00±0.05） in the normal control group]， the ROS level increased [（50.61±6.75） in the high glucose group， （23.44±4.18） in the normal control group]， the apoptosis rate of the cells increased [（36.62±3.15） in the high glucose group， （4.53±0.26） in the normal control group]， and the cell activity decreased [（0.91±0.17） in the high glucose group， （1.65±0.25） in the normal control group]. Different concentrations of sildenafil could upregulate the protein expression of Nrf-2 in the cells， reduce the ROS level in the cells， inhibit the cell apoptosis and improve the cell activity on Schwann cells cultured in high glucose. Conclusion Sildenafil may protect Schwann cells in high glucose environment by activating Nrf-2 signaling pathway to induce antioxidant stress.

[Key words] High glucose; Sildenafil; Schwann cell; Oxidative stress（OS）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病發(fā)生率最高的并發(fā)癥。在病史大于20年的糖尿病患者中，DPN發(fā)生率超過50%[1，2]，DPN可出現(xiàn)軀體感覺障礙和下肢潰瘍，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者下肢截肢，這不僅影響患者的日常生活，同時也給家庭、社會和國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟負(fù)擔(dān)[3]。DPN的病因發(fā)病機制尚不清楚，目前治療DPN的常規(guī)藥物只能延緩 DPN 的發(fā)生和發(fā)展，不能有效地治療或逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的 DPN[4，5]。因此，探索DPN機制及防治方法對提高患者存活率和改善其生活質(zhì)量具有重要的臨床實踐意義。近年來提出的DPN統(tǒng)一機制學(xué)說表明高糖可引起線粒體中活性氧自由基（ROS）生成過多，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而最終導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變[6]。本文前期研究采用西地那非（Sildenafil，Sil）干預(yù)糖尿病腎?。―N）大鼠，首次發(fā)現(xiàn)抗氧化應(yīng)激分子 Nrf-2分子的表達(dá)水平在干預(yù)后顯著提升，此結(jié)果預(yù)示Nrf-2 通路的抗氧化應(yīng)激機制參與了改善腎損傷[7]。故本研究將探討西地那非對高糖環(huán)境下大鼠施旺細(xì)胞（rat Schwann cell，RSC96）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

新生5 d Wistar大鼠（溫州醫(yī)科大學(xué)動物房提供）;DMEM培養(yǎng)基（美國THERMO公司）;PBS、膠原酶（Collage-rlase NB4，德國SERVA公司）;中性蛋白酶（dispase Ⅱ，美國SIGMA公司）;高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶（美國 HyClone公司）;D-葡萄糖（北京 Solarbio公司）;雙抗（美國 Bio-sharp公司）;CCK-8 試劑盒（日本同仁公司）;西地那非50 mg/片（美國輝瑞公司），Nrf-2 和β-actin（英國 abcam公司）細(xì)胞凋亡試劑盒，離心機（美國 Beckman公司），倒置相差顯微鏡（日本 Olympus公司）。

1.2 施旺細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及標(biāo)記鑒定

將新生5 d Wistar鼠采用乙醚麻醉后，取下整段坐骨神經(jīng)，置于平衡鹽液體中進(jìn)行分離，注意無菌條件和仔細(xì)剝離神經(jīng)外膜。坐骨神經(jīng)剪碎后將松散組織置于含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每 3天換液1次。觀察細(xì)胞生長情況備用，采用差速貼壁法進(jìn)行純化培養(yǎng)。通過形態(tài)學(xué)觀察及應(yīng)用 ABC 法免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行施旺細(xì)胞鑒定[8]。

1.3 實驗分組

根據(jù)前期工作，高糖濃度為50 mmol/L葡萄糖，干預(yù)時間為48 h[9，10]。將施旺細(xì)胞分組如下：①正常對照組（con）：5.6 mmol/L葡萄糖培養(yǎng);②高糖組（HG）：50 mmol/L葡萄糖培養(yǎng);③滲透壓對照組（mannitol）：5.6 mmol/L葡萄糖+44.4 mmol/L甘露醇培養(yǎng);④高糖加不同濃度西地那非組（西地那非濃度分別為 10、30、100 μmol/L） 。

1.4 各組細(xì)胞活性檢測

施旺細(xì)胞活性檢測采用CCK-8法：細(xì)胞倍增時間取培養(yǎng)的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制備3×104個/mL的細(xì)胞懸液，按每孔1500個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組4個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜，然后按照實驗分組，各組加入培養(yǎng)基 200 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，每孔加入 100 μL標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和10 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，應(yīng)用超微量分光光度計測定450 nm處的吸光度，重復(fù)檢測3次。

1.5細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測

細(xì)胞內(nèi)ROS采用熒光探針 2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測。培養(yǎng)結(jié)束后向培養(yǎng)板的細(xì)胞中加入DCFH-DA，使其終濃度為12 μmol/L。在室溫、5%CO2的條件下孵育20 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強度（激發(fā)探針熒光信號的光波為485 nm，用熒光顯微鏡記錄熒光信號），分析和計算施旺細(xì)胞內(nèi)的光密度值。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測

經(jīng)不同條件作用48 h后，0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，用多聚甲醛固定經(jīng)PBS洗滌二次后的各組施旺細(xì)胞，孵育打孔后滴加Tunnel反應(yīng)液，混合均勻，在室溫條件下濕盒中避光孵育1 h。經(jīng)PBS洗滌三次后滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察，一旦出現(xiàn)棕黃色顆粒即終止反應(yīng)。施旺細(xì)胞核呈深棕為陽性。隨機選取5個視野下凋亡細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)的比值表示每組細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測Nrf-2的表達(dá)

培養(yǎng)結(jié)束后分組提取細(xì)胞的全部蛋白，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法定量并調(diào)整蛋白濃度為 5 μg/μL，加入蛋白上樣緩沖液混勻。取樣品經(jīng)10%的分離膠電泳2 h后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，室溫條件下BSA封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜后洗滌一抗，洗滌要充分，再加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。充分洗滌二抗后 ECL顯色、曝光和拍照，圖像軟件對蛋白條帶的光密度值進(jìn)行分析，Nrf-2蛋白相對表達(dá)量以β-actin作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行結(jié)果分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用單因素方差分析比較組間差異，兩組間比較用Student-Newman-Keuls，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞純度

施旺細(xì)胞特異性蛋白采用S-100標(biāo)記，經(jīng)免疫熒光染色后，可以使表達(dá)S-100蛋白的施旺細(xì)胞胞漿發(fā)出綠色熒光。所有活細(xì)胞的細(xì)胞核經(jīng)DAPI內(nèi)的DNA結(jié)合后發(fā)出藍(lán)色熒光。通過每次5個樣本的S-100陽性細(xì)胞計數(shù)與DAPI陽性細(xì)胞計數(shù)的比例得到施旺細(xì)胞純度，計算3次，平均細(xì)胞純度為（94.8±0.27）%。見封三圖2、表1。

2.2 西地那非對施旺細(xì)胞活性的影響

與正常對照組相比，高糖組細(xì)胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與高糖組相比，不同劑量西地那非干預(yù)后細(xì)胞活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。滲透壓對照組細(xì)胞活性與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2、圖1。

2.3 西地那非對細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化

高糖組施旺細(xì)胞內(nèi)ROS水平與正常對照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與高糖組相比，西地那非干預(yù)后，施旺細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。滲透壓對照組與正常對照組施旺細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2、圖1。

2.4 西地那非對各組細(xì)胞凋亡率的影響

高糖組施旺細(xì)胞凋亡率與正常對照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。西地那非干預(yù)后施旺細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。滲透壓對照組與正常對照組相比施旺細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表 2、圖1。

注：Sil：西地那非;與正常對照組比較，*P<0.01;與高糖（HG）組比較，#P<0.01

2.5 各組細(xì)胞Nrf-2蛋白表達(dá)

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：與正常對照組相比，高糖組Nrf-2蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與高糖組相比，不同劑量西地那非干預(yù)后Nrf-2蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。滲透壓對照組Nrf-2蛋白表達(dá)與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3、圖2、3。

注：Sil：西地那非;與正常對照組比較，*P<0.01;與高糖（HG）組比較，#P<0.01

3 討論

盡管高糖是DPN 發(fā)病的首要因素，但具體機制仍未闡明。高糖可以通過多元醇途徑的細(xì)胞內(nèi)山梨醇堆積啟動氧化應(yīng)激，通過蛋白激酶C激活導(dǎo)致糖、脂肪代謝障礙，通過蛋白質(zhì)及核酸非酶促糖基化增加引起蛋白質(zhì)及核酸功能失常等途徑導(dǎo)致DPN[9]，然而線粒體內(nèi)ROS生成過多是目前公認(rèn)的導(dǎo)致糖尿病周圍神經(jīng)病變的核心機制[10]。節(jié)段性脫髓鞘是DPN最主要的病理改變，而周圍神經(jīng)的髓鞘是由施旺細(xì)胞形成的，施旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)損害修復(fù)中起著重要的作用，因此成為DPN治療中非常重要的靶細(xì)胞[11]。

ROS是在維持細(xì)胞三羧酸循環(huán)過程中產(chǎn)生的。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)可以通過MnSOD、GPX等酶清除ROS以保持細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡。但機體在缺氧、高糖等病理條件下細(xì)胞內(nèi)ROS清除能力會顯著下降，同時ROS的產(chǎn)生會增加，導(dǎo)致機體內(nèi)ROS 的大量堆積，從而造成組織器官的氧化應(yīng)激損傷。因此ROS是反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的直接指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示體外高糖條件下培養(yǎng)48 h的施旺細(xì)胞內(nèi)ROS濃度明顯增高，施旺細(xì)胞凋亡率明顯上升，表明高糖可以顯著提高施旺細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而滲透壓對照組的結(jié)果提示高糖是引起施旺細(xì)胞損害的直接原因，與滲透壓無關(guān)。

西地那非是一種5型磷酸二酯酶抑制劑（PDE-5i），已被用于治療勃起功能障礙[13]。其通過抑制PDE-5使NO-cGMP-PKG通路中cGMP濃度上升，通過抑制超氧化物形成來降低氧化應(yīng)激[14，15]。Wang L等[16]證實，PDE-5i可顯著增加糖尿病小鼠坐骨神經(jīng)中的功能性血管和局部血流量，同時增加坐骨神經(jīng)的神經(jīng)纖維密度和感覺傳導(dǎo)速度。Nrf-2可以控制多種抗氧化基因和酶對氧化應(yīng)激的表達(dá)，屬于轉(zhuǎn)錄因子CNC家族。其與胞漿蛋白伴侶分子Keap1結(jié)合時處于抑制狀態(tài)，Nrf-2發(fā)生磷酸化后解偶聯(lián)、轉(zhuǎn)移入核，識別并結(jié)合ARE結(jié)構(gòu)，啟動如HO-1、GST、SOSTM等在內(nèi)的一系列抗氧化蛋白表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮抗氧化效果[17，18]，最近的研究發(fā)現(xiàn)Nrf-2在坐骨神經(jīng)中亦有很好的表達(dá)和活化[19-21]。本研究以三種濃度西地那非處理高糖培養(yǎng)施旺細(xì)胞，結(jié)果顯示西地那非改善了高糖對施旺細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，西地那非組較高糖組，其施旺細(xì)胞活性增加，凋亡率下降，表明西地那非對高糖環(huán)境下施旺細(xì)胞具有保護(hù)作用，同時西地那非可以顯著提升施旺細(xì)胞 Nrf-2 蛋白的表達(dá)水平，提示西地那非可能通過激活Nrf-2信號通路誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激改善高糖對施旺細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，高糖可通過促進(jìn)施旺細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而西地那非可能通過激活Nrf-2信號通路誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激改善高糖對施旺細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)高糖環(huán)境下施旺細(xì)胞，這可能為西地那非在DPN的臨床治療提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-12-10）