表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的改善作用

劉文雄 陳 波

(陜西省西安市西電集團(tuán)醫(yī)院麻醉科，西安市 710077，電子郵箱：2920695983@qq.com)

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛是臨床上糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，約有50%的糖尿病患者患有不同程度的神經(jīng)病理性疼痛癥狀[1-2]。糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的主要臨床表現(xiàn)為自發(fā)性和誘發(fā)性的疼痛以及痛覺的過敏和超敏，嚴(yán)重者可繼續(xù)發(fā)展為糖尿病足甚至截肢；同時(shí)，疼痛可長期影響糖尿病患者的睡眠質(zhì)量和精神狀態(tài)，降低糖尿病患者的生活質(zhì)量[3-4]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是綠茶提取物綠茶多酚成分中含量最多的組分。既往大量研究顯示，EGCG具有較強(qiáng)的抗氧化和抗腫瘤效應(yīng)[5-6]，亦具有顯著的抗炎效應(yīng)，能夠顯著下調(diào)炎性相關(guān)因子的表達(dá)和分泌，包括白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-8以及巨噬細(xì)胞趨化因子等[7-8]。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EGCG具有一定程度的鎮(zhèn)痛效果[9-10]。但是，EGCG能否緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛癥狀，迄今國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)構(gòu)建速發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型，分析不同濃度的EGCG對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的緩解效果，以及對(duì)大鼠脊髓p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和IL-1β基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級(jí)雄性SD大鼠50只，均為3月齡，體重280～295 g，購于中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可號(hào)：20160209)。全部大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)恒溫(23±1)℃、恒濕(濕度50%～60%)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器 STZ溶液(批號(hào)：V900890)、戊巴比妥鈉溶液(批號(hào)：P-010)均購于美國Sigma公司；EGCG購于美國APExBIO公司(批號(hào)：A2600)。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京天根生物技術(shù)公司(批號(hào)：KR106)，Maxima?SYBR Green qPCR試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司(批號(hào)：K0221)，RNA提取試劑TRIzol購于美國Invitrogen公司(批號(hào)：15596018)。熒光定量PCR儀購自Bio-Rad 公司(型號(hào)：CFX96)。便攜式血糖測試分析儀購于美國LifeScan公司(型號(hào)：ONE-TOUCH)。Von Frey纖維絲購于美國Stoelting公司(批號(hào)：52735)。熱痛敏刺激和測量系統(tǒng)購于意大利Commat公司(型號(hào)：May AHP 0603)。

1.3 分組及動(dòng)物模型構(gòu)建方法 所有大鼠根據(jù)體重，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為對(duì)照組、糖尿病組、10 mg/kg EGCG組、50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組，每組10只。除對(duì)照組外，其余4組大鼠通過腹腔注射STZ溶液(55 mg/kg)構(gòu)建胰島素依賴糖尿病動(dòng)物模型，對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。注射72 h后通過血糖測量儀檢測各組大鼠隨機(jī)血糖值，注射STZ溶液的所有大鼠隨機(jī)血糖值均高于14.0 mmol/L，并表現(xiàn)出多飲、多食、多尿的“三多”特征，符合糖尿病建模標(biāo)準(zhǔn)。隨后3個(gè) EGCG組大鼠給予相應(yīng)劑量的EGCG灌胃，其他兩組大鼠給予相同體積的生理鹽水灌胃處理，均1次/d，連續(xù)灌胃8周。于開始給予EGCG處理后的第4周和第8周，使用血糖測量儀檢測各組大鼠隨機(jī)血糖值。

1.4 大鼠足底纖維力度的測定 于開始給予EGCG處理后的第4周和第8周，分別測定各組大鼠的足底纖維力度。將大鼠置于金屬網(wǎng)中，其上蓋有透明的樹脂玻璃罩，令大鼠充分適應(yīng)該環(huán)境30 min。隨后使用Von Frey纖維絲按自足跟至足尖的順序刺激大鼠足底中部，使纖維發(fā)生彎曲。在刺激過程中或移開纖維絲瞬間大鼠出現(xiàn)明顯的抬足、躲避、舔腳等反應(yīng)，則記為陽性反應(yīng)。每一標(biāo)號(hào)的纖維對(duì)每側(cè)足底刺激5次(雙側(cè)共10次)，每次刺激持續(xù)5 s，間隔15 s，如出現(xiàn)5次以上陽性反應(yīng)，則記錄該纖維力度。如果發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)5次不抬腿的情況，則換用更高刻度的纖維。

1.5 大鼠足底反應(yīng)時(shí)間的測定 于開始給予EGCG處理后的第4周和第8周，分別測定各組大鼠的足底反應(yīng)時(shí)間。將大鼠置于獨(dú)立的有機(jī)玻璃籠中，令大鼠充分適應(yīng)該環(huán)境30 min。通過應(yīng)用熱輻射測痛儀對(duì)大鼠足底中心位置進(jìn)行熱光束刺激(刺激光源強(qiáng)度為55℃)，大鼠因難以耐受熱痛出現(xiàn)抬足反應(yīng)，此時(shí)光束會(huì)自動(dòng)切斷并自動(dòng)記錄反應(yīng)時(shí)間。對(duì)每只大鼠的每側(cè)足底共刺激5次(雙側(cè)共10次)，每次間隔10 min，記錄10次的反應(yīng)時(shí)間測量值并取其平均值。

1.6 大鼠脊髓p38 MAPK和IL-1β基因表達(dá)水平的測定 于給予EGCG處理8周后，使用過量戊巴比妥鈉麻醉處死各組大鼠，分離大鼠腰段脊髓L5背角組織。使用RNA提取試劑盒提取大鼠L5背角總RNA，隨后以2 μg RNA為上樣量，按照試劑盒說明書操作步驟，在20 μL反應(yīng)體系中對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀對(duì)所選取的目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：p38MAPK上游引物：5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′，下游引物：5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′；IL-1β上游引物：5′-TGATGTTCCCATTAGACAGC-3′，下游引物：5′-GAGGTGCTGATGTACCAGTT-3′；GAPDH上游引物：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物：5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。qPCR的反應(yīng)體系：cDNA模板1.6 μL，上、下引物(濃度為10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，最后使用去離子水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至20 μL。具體反應(yīng)條件：95℃變性處理3 min，95℃、60℃各30 s，循環(huán)40次后，進(jìn)行55℃退火處理15 s。每種基因設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，使用2-ΔΔCt法對(duì)p38MAPK和IL-1β的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析，使用基于Bonferroni的多重檢驗(yàn)分析方法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的足底纖維力度及反應(yīng)時(shí)間比較 在第4、8周，5組大鼠的足底纖維力度及反應(yīng)時(shí)間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，糖尿病組及各劑量EGCG組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間均低于對(duì)照組(均P<0.05)；與糖尿病組比較，50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組各時(shí)間點(diǎn)的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間均增高(均P<0.05)，10 mg/kg EGCG組第8周的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間均增高(均P>0.05)；50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間均高于10 mg/kg EGCG組(均P<0.05)，但50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的足底纖維力度及反應(yīng)時(shí)間比較(x±s)

2.2 不同濃度EGCG對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠隨機(jī)血糖的影響 在第4、8周，5組大鼠的隨機(jī)血糖比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中糖尿病組及各劑量EGCG組的隨機(jī)血糖高于對(duì)照組(均P<0.05)。但3個(gè)劑量的EGCG組之間隨機(jī)血糖值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且與糖尿病組差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的隨機(jī)血糖水平比較(x±s，mmol/L)

2.3 不同濃度EGCG對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表達(dá)的影響 于給予EGCG處理第8周，5組大鼠脊髓組織p38MAPK和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，糖尿病組和10 mg/kg EGCG組的p38MAPK和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，50 mg/kg EGCG組的IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平亦高于對(duì)照組(均P<0.05)；50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組的p38MAPK和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于糖尿病組及10 mg/kg EGCG組(均P<0.05)，而糖尿病組及10 mg/kg EGCG組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組大鼠脊髓組織p38MAPK和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

3 討 論

近年來，綠茶多酚的主要成分EGCG(約占茶多酚總量的80%)的藥理學(xué)效應(yīng)逐漸受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。已有研究表明EGCG具有顯著的抗菌、抗氧化和抗腫瘤生成效應(yīng)[11]。此外，EGCG能夠?qū)寡茉錾脱苤械难ㄐ纬蒣12]。同時(shí)，EGCG也被證實(shí)具有十分顯著的抗炎效應(yīng)，對(duì)于細(xì)胞炎性因子的表達(dá)以及炎癥相關(guān)疾病的進(jìn)展具有顯著的抑制效果[13]。更重要的是，最近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，EGCG能明顯緩解機(jī)體疼痛[9-10]。這為EGCG對(duì)抗最重要且危害最大的糖尿病并發(fā)癥—糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，提供了充分的理論依據(jù)。與目前臨床上常見的緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的治療藥物相比，如抗抑郁類藥物、抗驚厥類藥物和鎮(zhèn)痛類藥物，EGCG具有副作用更小和治療成本更低的優(yōu)勢(shì)。

STZ能夠迅速破壞負(fù)責(zé)產(chǎn)生胰島素的胰島B細(xì)胞，從而導(dǎo)致胰島素分泌減少和血糖急劇升高。因此本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射STZ構(gòu)建胰島素依賴性速發(fā)型糖尿病大鼠模型。同時(shí)，大量的研究顯示，通過注射STZ構(gòu)建的糖尿病大鼠也能夠表現(xiàn)出糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的癥狀，包括機(jī)械疼痛閾值和反應(yīng)時(shí)間的顯著降低，以及神經(jīng)傳導(dǎo)速率的顯著下降[14-15]。而在本研究中，通過STZ腹腔注射建模的大鼠的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間均低于對(duì)照組大鼠(均P<0.05)，且這種疼痛閾值在建模成功后的8周內(nèi)一直維持在較低水平，即糖尿病大鼠均具有糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的典型特征，提示成功建立了糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型。進(jìn)一步分析不同濃度的EGCG對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的作用效果，結(jié)果顯示，第4周時(shí)10 mg/kg EGCG組與糖尿病組的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，第8周時(shí)10 mg/kg EGCG組的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間高于糖尿病組(P<0.05)，這提示在早期10 mg/kg的EGCG對(duì)于糖尿病大鼠纖維力度及反應(yīng)時(shí)間的改變效果較為微弱，只在EGCG治療8周后才開始產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在第4、8周，50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間均高于對(duì)照組及10 mg/kg EGCG組(均P<0.05)，說明50 mg/kg的EGCG和100 mg/kg的EGCG在第4周即可對(duì)糖尿病大鼠的纖維力度及反應(yīng)時(shí)間具有較為顯著的改善效應(yīng)，且作用優(yōu)于10 mg/kg的EGCG。因此，EGCG能顯著緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，并具有一定的量效關(guān)系。此外，3個(gè)劑量的EGCG組與糖尿病組的隨機(jī)血糖值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明EGCG的應(yīng)用對(duì)糖尿病大鼠的血糖沒有顯著影響。

MAPK信號(hào)是細(xì)胞中一個(gè)十分重要的信號(hào)通路，它能夠介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥等一系列細(xì)胞反應(yīng)。而大量的研究也表明，MAPK在糖尿病患者和動(dòng)物的脊髓和背根神經(jīng)中被廣泛激活，且在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的中樞和外周敏化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[16-17]。而p38亞型作為MAPK的主要亞型之一，也已被證實(shí)在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組的p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了p38MAPK在糖尿病動(dòng)物的脊髓組織中被廣泛激活。此外，50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組的p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于糖尿病組(均P<0.05)，提示50 mg/kg和100 mg/kg的EGCG能夠顯著抑制糖尿病大鼠脊髓中p38MAPK的基因表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)10 mg/kg的EGCG對(duì)p38MAPK的表達(dá)有顯著的抑制效應(yīng)。以上EGCG的量效結(jié)果與其對(duì)于纖維力度和反應(yīng)時(shí)間的作用效果類似，進(jìn)一步表明p38MAPK的表達(dá)抑制可能在EGCG緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。此外，糖尿病組的 IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，而IL-1β是最重要且具有代表性的細(xì)胞炎性因子，提示糖尿病的脊髓組織處于炎性因子高表達(dá)狀態(tài)。既往研究表明，EGCG能夠抑制不同病理狀態(tài)下組織細(xì)胞中的炎性因子IL-1β的表達(dá)[8]。在本研究中，50 mg/kg EGCG組和100 mg/kg EGCG組的IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于糖尿病組(均P<0.05)，這進(jìn)一步證實(shí)了EGCG具有較強(qiáng)的抗炎性效應(yīng)，并提示50 mg/kg和100 mg/kg的EGCG能夠顯著抑制糖尿病大鼠脊髓組織的炎癥反應(yīng)。

綜上所述， EGCG可以緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，并具有一定的量效關(guān)系，而其可能通過抑制脊髓組織中p38MAPK的表達(dá)以及炎癥反應(yīng)而發(fā)揮作用。這或可為EGCG廣泛應(yīng)用于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。