大蠟螟卵粒快速計數(shù)法

張俊俊 王桂珍 尹志龍 劉平臻 汪正威 │文

1 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)學(xué)重點實驗室，昆明650223；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3 云南普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院

大蠟螟（Galleria mellonellaL.）是蜜蜂重要的害蟲，其幼蟲寄生于蜂巢內(nèi)，喜上脾吞食蜂巢，善鉆蛀隧，損壞蜂巢，又被稱為“巢蟲”[1]。大蠟螟危害嚴(yán)重時，中蜂群內(nèi)會產(chǎn)生大量“白頭蛹”，導(dǎo)致子脾不能正常羽化[2]，當(dāng)無法得到控制時便會棄巢飛逃，其幼蟲會破壞蜂群內(nèi)所有空巢脾。而大蠟螟對意蜂的危害則主要表現(xiàn)在侵染弱群，破壞蜜粉脾，給蜂農(nóng)造成不可估量的經(jīng)濟損失。

圖1 大蠟螟生活史（a 卵，b 幼蟲，c 蛹，d 成蟲）

大蠟螟為完全變態(tài)昆蟲，生長周期分四個階段：卵、幼蟲、蛹、成蟲[1]（圖1）。自然條件下，發(fā)育期長短隨季節(jié)變化而略有差異。據(jù)報道，大蠟螟卵期8～23天，初產(chǎn)卵呈短橢圓形，卵殼較硬且厚，隨孵化時間增加逐漸由乳白色變?yōu)辄S褐色，表面開始布有網(wǎng)狀刻紋，其卵塊一般為單層，卵粒緊密排列。大蠟螟幼蟲共8齡[1]，每齡期4～7天，因外界溫度和食料不同而略有差異，2～3齡幼蟲外形會發(fā)生很大變化，成熟幼蟲體長12～28mm，重量可達(dá)240mg；老熟幼蟲吐絲結(jié)繭化蛹，繭為白色絲織物，厚密結(jié)實，兩端絲織疏松，呈長橢圓形。蛹期6～55天，蛹呈紡錘形，化蛹初期為淡黃色，羽化前呈褐色或黑色。雌蛾個體較雄蛾大，在自然條件下，雌蛾歷期7～9天，體長18～22mm，重達(dá)123±2mg，羽化后1～3小時開始交尾，交尾4～5小時后產(chǎn)卵，平均產(chǎn)卵量725±149粒，雄蛾歷期1 2～2 4 天，體長14～16mm，重74.0±7mg[1-2,4]。大蠟螟成蟲口器退化，在成蟲期不取食，危害較大的是幼蟲期（巢蟲），其幼蟲會取食蜂群巢脾，1～2齡幼蟲會蛀食巢脾，并在巢脾上吐絲作繭，嚴(yán)重?fù)p壞巢脾結(jié)構(gòu)、蛀蝕蜂具[3]。蠟螟幼蟲除破壞巢脾外，還會危及蜂群中的封蓋子脾。除此之外，3～4齡幼蟲會造成蜂群蛹和幼蟲大量死亡，使得蜜蜂群勢潰敗。

大蠟螟是全球范圍內(nèi)普遍存在的蜜蜂害蟲，不僅危害蜂群，還威脅蜂產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量[5]。一對雌雄大蠟螟日產(chǎn)卵量在100～900粒以上，最高可達(dá)2000粒，300頭蛹日出蟲率可達(dá)67%以上，并在2天內(nèi)完成交配，可見蠟螟產(chǎn)卵量之多，出蟲率之快，交配率之高，繁殖速率之快，產(chǎn)生的危害之大。但是尚未有能夠有效、快速檢測蠟螟蟲卵數(shù)量的方法。本文介紹三種能夠在實驗室內(nèi)快速檢測大蠟螟蟲卵數(shù)量的方法，以期找到優(yōu)化、便捷的蟲卵計數(shù)法，用于對大蠟螟種群數(shù)量變化的動態(tài)監(jiān)測。

一、大蠟螟實驗室養(yǎng)殖條件

1.大蠟螟來源

圖2 A 直接計數(shù)法，B Motic 面積計數(shù)法，C PS 像素計數(shù)法

采集受大蠟螟侵染的蜂群，實驗室人工培養(yǎng)3代后用于試驗，培養(yǎng)箱條件為溫度27℃～32℃，相對濕度65%～75%。

2.飼料配方

采用黃誠華等[6]研發(fā)的優(yōu)化配方，即每份飼料添加酵母粉5.40g、甘油24.00g、奶粉10.20g、蜂蜜11.76g、蜂蠟16.68g、面粉51.96g。

3.卵塊收集

大蠟螟幼蟲分批次飼養(yǎng)，每一批次飼養(yǎng)200～400頭，再分別用飼養(yǎng)盒分裝大幼蟲，每盒50～60頭。根據(jù)大蠟螟雌雄蛹的體型差異判斷，在蛹期將大蠟螟按雌雄分開養(yǎng)殖。待蛹羽化后，隨機選擇雌雄成蟲交配產(chǎn)卵，收集當(dāng)天產(chǎn)下的卵塊進(jìn)行試驗。

二、卵塊計數(shù)方法

首先，隨機挑選產(chǎn)卵后的紙片，選出三個卵粒范圍的紙片各10張（下稱卵片），卵粒范圍設(shè)置：≤100粒，100～200粒，≥300粒，并給每張卵片依次編號，以供試驗使用。分別用人工直接計數(shù)法、Motic Images plus 2.0 ML軟件面積計數(shù)法（簡稱Motic面積計數(shù)法）、Adobe Photoshop軟件像素計數(shù)法（簡稱PS像素計數(shù)法）計算卵粒數(shù)量，并記錄每種方法在不同卵粒范圍計數(shù)時所消耗的時間（圖2）。

1.人工直接計數(shù)法

選擇干凈帶卵的紙張，按照編號順序依次在體式顯微鏡下觀察，人工計數(shù)，記錄每張卵片的蟲卵數(shù)量。

2.Motic面積計數(shù)法

選擇干凈的卵片，按照編號順序依次在體式顯微鏡下觀察，將Motic Images plus 2.0 ML軟件與體式顯微鏡連接，使用該軟件對每一張卵片進(jìn)行圖片采集，并對每張圖片編號保存。隨即將圖片導(dǎo)回到軟件中進(jìn)行處理，步驟如下：（1）選擇測量工具；（2）再選擇不規(guī)則多邊形框選工具，手動對每個圖片中蟲卵區(qū)域進(jìn)行描邊，軟件會自動計算出所選擇區(qū)域面積；（3）最后用該方法隨機框選出5顆卵粒面積，并求單粒面積平均值，通過計算可得出：總卵粒數(shù)（粒）=總卵粒區(qū)域面積/單粒面積平均值。

3.PS像素計數(shù)法

選擇干凈的卵片，按照編號順序依次在體式顯微鏡下觀察，將Motic Images plus 2.0 ML軟件與體式顯微鏡連接，使用該軟件對每一張卵片進(jìn)行圖片采集，并對每張圖片編號保存。隨后將圖片導(dǎo)入到Adobe Photoshop CC 2017軟件中使用像素框選計數(shù)卵數(shù)，步驟如下：（1）選擇像素框選工具中的魔棒工具對照片中蟲卵區(qū)域自動進(jìn)行框選，容差調(diào)為0；（2）再用矩形選框工具，或者橢圓選框工具，手動微調(diào)多選和漏選的區(qū)域，以減小誤差：（3）選框完成后，選擇直方圖，記錄軟件直接計算出的像素大小；（4）再用套索工具，隨即隨機選擇5顆卵粒，同樣選擇直方圖，計算其像素平均值，通過計算可得出：總卵粒數(shù)（粒）=總蟲卵區(qū)域像素值/單粒像素平均值。

三、結(jié)果與討論

1.三種方法對三種卵粒范圍的卵粒數(shù)量

研究結(jié)果：三種計數(shù)方法分別對同一卵塊范圍計數(shù)，在卵塊范圍≤100粒時，卵粒數(shù)量依次為：直接計數(shù)法為61±6.307粒（Mean±SE，下同），Motic面積計數(shù)法為65±6.943粒，PS像素計數(shù)法為63±5.681粒；在卵塊范圍在100～200粒時，直接計數(shù)法為163±17.704粒，Motic面積計數(shù)法為160±15.467粒，PS像素計數(shù)法為168±16.700粒；在卵塊范圍≥300粒時，直接計數(shù)法為451±44.708粒，Motic面積計數(shù)法為422±35.331粒，PS像素計數(shù)法為453±51.636粒。通過對卵粒數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明：同一卵塊范圍，不同計數(shù)方法的卵粒數(shù)量之間的差異均不顯著（P＞0.05）；而同一計數(shù)方法，不同卵塊范圍的卵粒數(shù)量之間的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）（圖3）。

圖3 三種方法計數(shù)三種卵塊范圍的卵粒數(shù)量

2.討論

本研究結(jié)果說明，Motic面積計數(shù)法和PS像素計數(shù)法，同樣適用于蠟螟蟲卵卵粒的計數(shù)，無論是較低的卵塊范圍，還是較高的卵塊范圍，兩種方法均表現(xiàn)出較強的可信度，與人工直接計數(shù)法計算的卵粒數(shù)差異較小，這兩種卵粒計數(shù)法均適用于大蠟螟蟲卵的計數(shù)。當(dāng)單次產(chǎn)卵總卵粒數(shù)小于100粒時，使用人工直接計數(shù)法觀察計數(shù)較此兩種方法更節(jié)省時間，且具有計數(shù)更準(zhǔn)確的優(yōu)點，出現(xiàn)的誤差比自動計數(shù)法更小。但是，當(dāng)卵粒數(shù)大于100粒以上，隨著卵粒數(shù)量的增加，三種方法比較可知：人工直接計數(shù)法耗時最長，PS像素計數(shù)法次之，Motic面積計數(shù)法最節(jié)省時間。

大蠟螟對蜜蜂的危害，不僅表現(xiàn)在影響蜂群的發(fā)展壯大，還會影響其產(chǎn)蜜量及蜂蠟等蜂產(chǎn)品的品質(zhì)。大蠟螟快速的卵數(shù)計數(shù)方法，不僅可以幫助我們實時監(jiān)測大蠟螟的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，更有助于我們快速對其繁殖期蟲卵數(shù)量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控，做好蠟螟蟲情發(fā)生與預(yù)測工作，并對大蠟螟防治提供支撐。為了保護傳粉昆蟲，維持養(yǎng)蜂業(yè)的平穩(wěn)發(fā)展，使得蜂農(nóng)經(jīng)濟效益最大化，對大蠟螟的相關(guān)研究刻不容緩。