木丹顆粒聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療早期糖尿病腎病臨床療效及對(duì)患者Toll樣受體4/核因子κB、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad信號(hào)通路的影響

岳樹香 甄云鳳 霍麗梅

(河北省廊坊市人民醫(yī)院藥學(xué)部，河北 廊坊 065000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常出現(xiàn)的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病、腎衰竭甚至死亡的重要原因[1-2]。目前，西醫(yī)主要采用降糖、降壓、調(diào)脂、抗氧化、減少蛋白攝入等對(duì)癥措施延緩DN進(jìn)展，但其降低微量蛋白尿療效有限，大部分患者腎功能仍持續(xù)減退，并發(fā)展為腎衰竭[3-4]。因此，尋找有效防治DN的藥物是目前亟待解決的問(wèn)題，這對(duì)于延長(zhǎng)糖尿病患者生存期、改善預(yù)后至關(guān)重要。

木丹顆粒是用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的中藥制劑，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能等作用，并且有研究顯示其對(duì)糖尿病多種并發(fā)癥也有一定治療作用[5-6]。2017-05—2019-05，我們采用木丹顆粒治療早期DN 45例，并與西醫(yī)常規(guī)治療45例對(duì)照，觀察臨床療效及對(duì)患者Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smad信號(hào)通路的影響，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部90例均為河北省廊坊市人民醫(yī)院(50例)和河北省人民醫(yī)院(40例)內(nèi)分泌科住院的早期DN患者，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組。觀察組45例，男28例，女17例；年齡61～75歲，平均(63.84±8.23)歲；糖尿病病程6～18年，平均(8.57±0.99)年；DN病程2～8年，平均(3.64±0.47)年。對(duì)照組45例，男26例，女19例；年齡62～78歲，平均(64.02±8.62)歲；糖尿病病程7～19年，平均(8.70±1.03)年；DN病程1～9年，平均(3.59±0.45)年。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)微血管并發(fā)癥學(xué)組制訂的《糖尿病腎病防治專家共識(shí)(2014年版)》[7]。中醫(yī)診斷參照中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)制訂的《糖尿病腎病中醫(yī)防治指南》[8]，辨證為氣虛血瘀型。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合以上中醫(yī)、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，辨證為氣虛血瘀型；②年齡>18歲；③患者均自愿入組，且簽署知情同意書。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡<18歲；②重要臟器功能障礙者；③合并急慢性感染、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤者；④其他原因?qū)е碌哪I病或已經(jīng)接受治療者；⑤對(duì)本研究藥物過(guò)敏者。

1.3 治療方法

1.3.1 對(duì)照組 予常規(guī)西醫(yī)治療，包括降糖、降壓、調(diào)脂、控制飲食、適量運(yùn)動(dòng)等。降糖藥予鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370)500 mg，日3次口服；降壓藥予纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040217)80 mg，日1次口服。

1.3.2 觀察組 在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上加用木丹顆粒(遼寧奧達(dá)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080033)7 g，日3次口服。

1.3.3 療程 2組均治療3個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察2組治療前后空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、腎功能[血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿白蛋白排泄率(UAER)、腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)]及外周血單核細(xì)胞(PBMCs)TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA的表達(dá)。標(biāo)本采集：抽取患者空腹肘靜脈血10 mL，置于2個(gè)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中(5 mL/管)，一管常規(guī)離心后取血清，另一管采用Ficoll密度梯度離心法提取外周血PBMCs。采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(日本日立公司，7600-020型)測(cè)定FPG，試劑由四川邁克生物科技有限公司提供；采用糖化血紅蛋白測(cè)定儀(美國(guó)arkary公司，HA-8180型)及配套試劑測(cè)定HbA1c。腎功能檢測(cè)：采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(日本日立公司，7600-020型)測(cè)定血清Cr、BUN，試劑由四川邁克生物科技有限公司提供，并計(jì)算UAER、eGFR。PBMCs TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time-PCR)測(cè)定PBMCs TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)。Trizol試劑盒提取PBMCs總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA第1鏈，引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。于熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，7500型)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)各樣本測(cè)得的Ct值，設(shè)GAPDH為內(nèi)參基因，以2-△△Ct表示各樣本相對(duì)表達(dá)量，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由日本Takara公司提供。引物序列如下：①TLR4：5'-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3'(正向)，5'-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3'(反向)；②MyD88：5'-ATTTGCACTCAGCCTCTCTCCA-3'(正向)，5'-CGAGTCCAGAACCAAGATTTGG-3'(反向)；③NF-κB：5'-AGGCGTCAAGGGATT-3'(正向)，5'-GCGTCCATCCATGATAC-3'(反向)；④TGF-β1：5'-ACACTCCAGCTGGGCTCTA GAGGGAAGCGC-3'(正向)，5'-ACA CTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3'(反向)；⑤Smad2：TACCACTCTCTCCCCTGTCAAT-3'(正向)，5'-GCAAACCTAAGCAGAACCTCTC-3'(反向)：⑥Smad3：5'-CCATCTCCTACTACGAGCTGAA-3'(正向)，5'-CACTGCTGCATTCCTGTTGAC-3'(反向)；⑦Smad7：5'-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3'(正向)，5'-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3'(反向)；⑧GAPDH：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'(正向)，5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'(反向)。

1.5 療效標(biāo)準(zhǔn) 顯效：中醫(yī)臨床癥狀基本消失，證候積分減少≥90%；有效：中醫(yī)臨床癥狀明顯改善，證候積分減少70%～90%；無(wú)效：中醫(yī)臨床癥狀無(wú)改善甚至加重[9]。

2 結(jié) 果

2.1 2組治療前后FPG、HbA1c比較 見(jiàn)表1。

表1 2組治療前后FPG、HbA1c比較

由表1可見(jiàn)，治療后2組FPG、HbA1c均較本組治療前降低(P<0.05)，且觀察組均低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 2組治療前后Cr、BUN、UAER及eGFR比較 見(jiàn)表2。

表2 2組治療前后Cr、BUN、UAER及eGFR比較

由表2可見(jiàn)，治療后2組Cr、BUN、UAER較本組治療前均降低(P<0.05)，且觀察組均低于對(duì)照組(P<0.05)；治療后2組eGFR較本組治療前均升高(P<0.05)，且觀察組高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 2組治療前后PBMCs TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

表3 2組治療前后PBMCs TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)比較

由表3可見(jiàn)，治療后2組PBMCs TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)均較本組治療前降低(P<0.05)，且觀察組均低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 2組治療前后PBMCs TGF-β1/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表4。

表4 2組治療前后PBMCs TGF-β1/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)比較

由表4可見(jiàn)，治療后2組PBMCs TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)均較本組治療前降低(P<0.05)，Smad7 mRNA均升高(P<0.05)，且觀察組改善均優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5 2組臨床療效比較 見(jiàn)表5。

表5 2組臨床療效比較 例

由表5可見(jiàn)，2組總有效率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),觀察組療效優(yōu)于對(duì)照組。

3 討 論

近年來(lái)，全球糖尿病發(fā)病率高達(dá)20%～40%，而我國(guó)糖尿病發(fā)病率為10%，且呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[10]。DN主要病理特征為腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)累積，從而導(dǎo)致腎臟纖維化和腎小球?yàn)V過(guò)功能紊亂[11]。早期DN患者主要表現(xiàn)為微量白蛋白尿，隨著疾病進(jìn)展，腎功能持續(xù)惡化，從而出現(xiàn)大量白蛋白尿，若不能得到及時(shí)控制可進(jìn)一步導(dǎo)致腎衰竭，甚至死亡。DN發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展與遺傳因素、糖脂代謝紊亂、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮功能損傷等因素均有關(guān)。其中長(zhǎng)期高糖引起的糖代謝紊亂是腎臟病變的基礎(chǔ)，高糖不僅引起腎臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂，還能夠誘發(fā)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，這些因素均能損害腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮素-1(ET-1)等縮血管因子釋放增多，而一氧化氮(NO)等舒血管因子合成減少，導(dǎo)致腎血管收縮痙攣和腎組織血流灌注減少，進(jìn)一步加重腎損害。

目前，西醫(yī)治療DN主要采取對(duì)癥治療措施延緩疾病進(jìn)展。纈沙坦屬于血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑，能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷AngⅡ與血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1受體)結(jié)合控制血壓，改善腎小球毛細(xì)血管濾過(guò)功能及減輕腎小球硬化，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[12]。但是，西醫(yī)治療DN雖然能夠在一定程度上改善臨床癥狀和腎功能，但對(duì)于炎性反應(yīng)、腎纖維化的改善作用不理想，這可能是部分患者腎功能持續(xù)性減退最終發(fā)展為腎衰竭的重要原因。

DN屬中醫(yī)學(xué)“消渴病腎病”范疇，其病久可致氣虛，氣虛運(yùn)血無(wú)力，導(dǎo)致血瘀內(nèi)阻，脈絡(luò)閉塞，屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證。故治宜益氣活血，通絡(luò)止痛，標(biāo)本兼治。木丹顆粒中黃芪甘溫，補(bǔ)一身之氣，補(bǔ)益脾胃，利水消腫，為君藥；延胡索行氣止痛，三七活血化瘀，為臣藥，輔助君藥活血化瘀，通絡(luò)止痛；赤芍藥、丹參、川芎、紅花、蘇木、雞血藤為佐、使藥，加強(qiáng)活血化瘀之功，使氣行則血散?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪、丹參、赤芍、川芎等成分具有明顯的抗炎、抗纖維化、減輕氧化應(yīng)激、調(diào)解免疫、改善血流動(dòng)力學(xué)等作用，對(duì)于治療糖尿病及其慢性并發(fā)癥具有較好療效[13-15]。本研究結(jié)果顯示，觀察組臨床療效優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用木丹顆粒輔助治療早期DN療效優(yōu)于單純西藥治療。

FPG、HbA1c是反映DN患者血糖控制效果的可靠指標(biāo)；Cr、BUN、UAER、eGFR是評(píng)估腎功能的敏感指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，治療后觀察組FPG、HbA1c及Cr、BUN、UAER均低于對(duì)照組(P<0.05)，治療后觀察組eGFR高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用木丹顆粒輔助治療早期DN能夠有效糾正糖代謝紊亂，從而改善腎功能。

TLR4是TLRs家族的重要成員，廣泛分布于心臟、肝臟、腎臟等多種組織和細(xì)胞，與內(nèi)源性或外源性配體結(jié)合后通過(guò)其接頭蛋白MyD88結(jié)合，導(dǎo)致NF-κB的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)多種炎癥因子分泌和腎組織損傷加重。研究證實(shí)，DN小鼠腎組織高表達(dá)TLR4、MyD88、NF-κB，且其水平與腎組織炎性反應(yīng)程度具有正相關(guān)性，提示TLR4信號(hào)通路在炎性反應(yīng)介導(dǎo)的腎組織損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16-17]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，阻斷TLR4信號(hào)通路的異常激活能夠抑制嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的DN足細(xì)胞損傷[18]。另外，TLR4炎癥信號(hào)通路的激活也能夠引起TGF-β1/Smad信號(hào)通路活化，后者與腎臟纖維化密切相關(guān)，二者相互影響，相互作用，共同導(dǎo)致DN進(jìn)展。TGF-β1/Smad信號(hào)通路由TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)及其受體底物Smad蛋白家族信號(hào)分子組成，后者主要包括Smad2、Smad3、Smad7，其中Smad2、Smad3是活化型受體，TGF-β1與細(xì)胞膜上的TGF-βRⅡ結(jié)合形成復(fù)合物后促進(jìn)Smad2、Smad3磷酸化并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)與纖維化有關(guān)的基因表達(dá)；Smad7是抑制型受體，能夠抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活，減輕腎纖維化程度[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎組織Smad3表達(dá)上調(diào)，同時(shí)Smad7表達(dá)下調(diào)，藥物能夠通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路改善腎纖維化[21-22]。以上研究提示，阻斷TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)和腎纖維化可能成為DN治療的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，治療后觀察組PBMCs TLR4、MyD88、NF-κB mRNA及TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，Smad7 mRNA高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明木丹顆粒輔助治療早期DN通過(guò)抑制TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而降低與炎性反應(yīng)和纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子分泌，這可能是木丹顆粒發(fā)揮治療作用的分子機(jī)制之一。

綜上所述，木丹顆粒輔助治療早期DN能夠發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信號(hào)通路，從而抑制炎性反應(yīng)和纖維化有關(guān)。