基于槲皮素標(biāo)記的金屬有機(jī)框架放療聯(lián)合阿霉素誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的研究

羅麗芳 劉運(yùn)鐸 關(guān) 玥 陳秀瑋

宮頸癌是嚴(yán)重威脅全球女性生命健康的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率較高并逐漸呈年輕化趨勢(shì)[1]。目前，宮頸癌的臨床治療主要采用手術(shù)治療為主，放療、化療或生物治療為輔的聯(lián)合治療方法，但腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是絕大多數(shù)患者治療后復(fù)發(fā)的主要原因。且對(duì)于晚期或者復(fù)發(fā)性宮頸癌患者，現(xiàn)有的治療效果有限，并嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量。眾所周知，缺氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是細(xì)胞內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，也是機(jī)體對(duì)腫瘤缺氧微環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答的一種關(guān)鍵分子，有α和β兩個(gè)亞基組成，大量研究表明HIF-1α在惡性腫瘤中高表達(dá)，通過促進(jìn)下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[2]。目前國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)槲皮素(Quercetin，QU)有極強(qiáng)的抗腫瘤作用，其機(jī)制是通過多途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡等[3]。本研究旨在探討基于槲皮素標(biāo)記的金屬有機(jī)框架(Zr-MOF)放療(RT)聯(lián)合阿霉素(DOX)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用，為宮頸癌治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株(保存自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)；槲皮素(Aladdin公司，USA)；Caspase-3及HIF-1α抗體(Abcam公司，USA)；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司，USA)；將50 mg QU溶解在5 mL乙醇溶液中，加入10 mg Zr-MOF并分散到溶液中；再將該溶液保持在冰水浴中，搖動(dòng)6 h，離心獲得負(fù)載QU的Zr-MOF(Zr-MOF-QU)。將20 mg DOX溶解在5 mL乙醇溶液中，加入5 mg Zr-MOF-QU并分散到溶液中；再將該溶液保持在冰水浴中，搖動(dòng)6 h，離心獲得負(fù)載DOX的Zr-MOF-QU(Zr-MOF-QU-DOX)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞復(fù)蘇后，用含有10%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于含5% CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.2.2 放射條件 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在室溫下采用直線加速器6 MV-X射線進(jìn)行照射，平均劑量率為400 cGy/min，照射時(shí)間1 min，源床距為100 cm。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)分組與處理 將對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組、RT組、阿霉素處理組(Zr-MOF-DOX+RT)、QU處理組(Zr-MOF-QU+RT)及聯(lián)合處理組(Zr-MOF-QU-DOX+RT)；對(duì)照組是不做任何處理只含等量DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h；RT組是只含等量DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h進(jìn)行放射線下照射1 min；阿霉素處理組使用的藥物濃度為2 μg/mL，培養(yǎng)48 h進(jìn)行放射線下照射1 min；QU處理組使用槲皮素濃度為20 μmol/L，培養(yǎng)48 h進(jìn)行放射線下照射1 min；聯(lián)合處理組使用槲皮素和阿霉素濃度分別是20 μmol/L和2 μg/mL，培養(yǎng)48 h進(jìn)行放射線下照射1 min。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)過單純的胰酶消化處理后形成單細(xì)胞懸液，按照5×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)量將HeLa細(xì)胞鋪在6孔板上，并在37℃下孵育1天。實(shí)驗(yàn)分為五組(對(duì)照組、RT組、阿霉素處理組、QU處理組、聯(lián)合處理組)。用等量輻射劑量的X射線輻照除對(duì)照組外的四組細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。PBS連續(xù)清洗兩遍后，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，10 min后棄固定液，加入0.05%的結(jié)晶紫染色30 min，洗滌干燥后拍照并在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，通過計(jì)算菌落的存活率來評(píng)估不同處理組的增殖能力。

1.2.5 蛋白印跡分析 消化收集五組細(xì)胞，PBS洗兩次，裂解、離心，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。灌制SDS-PAGE膠，將蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔中，電泳完畢后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗Caspase-3(1∶1 000)、HIF-1α(1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h。置于顯像儀中顯影、拍照。蛋白條帶用Quanti Scan軟件進(jìn)行密度掃描分析。

1.2.6 免疫熒光分析 在五組實(shí)驗(yàn)組中，將爬好細(xì)胞的玻片用PBS洗滌三次，每次約3 min；4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS洗滌，透膜20 min；PBS洗滌，室溫封閉30 min，滴加足量預(yù)先稀釋好的一抗(Caspase-3、HIF-1α)，4℃孵育一抗過夜；24 h內(nèi)間斷浸潤爬片三次，每次時(shí)間約3 min，之后吸凈玻片上的液體，滴加預(yù)先已經(jīng)稀釋好的熒光二抗，室溫下孵育2 h；PBS洗滌，加入DAPI染料染核，室溫避光孵育5 min；PBS洗滌，在200倍熒光顯微鏡下，觀察蛋白熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各處理組細(xì)胞增殖活性

與對(duì)照組相比，RT組、阿霉素處理組、QU處理組及聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05)；與阿霉素處理組、QU處理組相比較，聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)；對(duì)照組和RT組細(xì)胞分別有85%和76%的集落形成，而阿霉素處理組、QU處理組及聯(lián)合處理組細(xì)胞存活率分別只有51%、47%和16%(圖1)。

圖1 不同組別中HeLa細(xì)胞增殖活性的差異Figure 1 The proliferation of HeLa cells was inhibited in different groups

2.2 蛋白印跡法檢測Caspase-3與HIF-1α蛋白含量的變化

與對(duì)照組比較，RT組、阿霉素處理組、QU處理組及聯(lián)合處理組中凋亡蛋白Caspase-3呈明顯上升趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且聯(lián)合處理組含量最高。而缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白水平在各處理組中表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合處理組中HIF-1α含量最低(圖2)。

圖2 不同組別中Caspase-3與HIF-1α蛋白含量的變化Figure 2 The expression of Caspase-3 and HIF-1α proteins in HeLa cells treated with the control，RT，Zr-MOF-DOX+RT，Zr-MOF-Qu+RT and Zr-MOF-Qu-DOX+RT groupsNote：A.The expression of Caspase-3 and HIF-1α proteins in HeLa cells was detected by Western blot；B-C.The intensity analysis for protein bands of HIF-1a and Caspase-3 in each group.* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，when compared with the control group.

2.3 免疫熒光法檢測各組凋亡蛋白及缺氧誘導(dǎo)因子含量變化

與對(duì)照組比較，RT組、阿霉素處理組、QU處理組及聯(lián)合處理組中凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)水平呈明顯上升趨勢(shì)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合處理組中Caspase-3表達(dá)水平最高，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，顯著高于其他組(P<0.001)(圖3)。

圖3 免疫熒光法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的熒光強(qiáng)度Figure 3 Fluorescence intensity of apoptosis-associated Caspase-3 protein was detected in HeLa cells by immunofluorescenceNote：A.Fluorescence imaging of Caspase-3 in each group；B.The intensity expression of Caspase-3 in each group.* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，when compared with the control group.### P<0.001，when compared with the RT、Zr-MOF-DOX+RT，Zr-MOF-QU+RT groups.

與對(duì)照組比較，RT組、阿霉素處理組、QU處理組及聯(lián)合處理組中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白表達(dá)水平呈明顯下降趨勢(shì)，熒光強(qiáng)度顯著減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合處理組中HIF-1α表達(dá)水平最低，熒光強(qiáng)度最弱，顯著低于其他組(P<0.01)(圖4)。

圖4 免疫熒光法檢測各組缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白的熒光強(qiáng)度Figure 4 Fluorescence intensity of hypoxia-inducible factor HIF-1α protein was detected in HeLa cells by immunofluorescence in each groupNote：A.Fluorescence imaging of HIF-1α in each group；B.The intensity expression of HIF-1α in each group.* P<0.05，** P<0.01，when compared with the control group.## P<0.01，when compared with the RT、Zr-MOF-DOX+RT，Zr-MOF-QU+RT groups.

3 討論

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是治療失敗的主要原因之一。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程受多種因素的影響，由于新生血管的形成及血管通透性的增加，腫瘤細(xì)胞容易穿透血管壁和淋巴管壁，從而為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供途徑[4-5]。如今同步放化療已經(jīng)成為中晚期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療。由于化療藥物毒副作用大，同時(shí)放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性差，因此找到一個(gè)安全而有效的放化療方案是臨床中需要解決的問題。

Zr-MOF材料由于其獨(dú)特的金屬離子及較高的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，自身即可呈現(xiàn)優(yōu)異的放射增敏性能，無須包裹其他離子結(jié)構(gòu)，且易于表面修飾和裝載各種藥物，可降解并且生物相容性良好[6]。納米顆粒已被證明可以提高氧水平和減輕腫瘤缺氧[7]，并且因納米載體尺寸小、生物相容性高、可體內(nèi)降解等多種特性，可通過表面修飾實(shí)現(xiàn)藥物靶向遞送[8]。美國德克薩斯州農(nóng)工大學(xué)Park等人報(bào)道了葉酸靶向且負(fù)載卟啉的鋯基NMOF用于Hela細(xì)胞的光動(dòng)力治療[9]。而且槲皮素是一種具有多種生物學(xué)活性的黃酮類化合物，廣泛分布于蔬菜、水果及多種中草藥中。研究顯示，具有抗氧化、抗病毒、抗過敏及抗血小板聚集等多重功效，可起到降低血壓、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等作用[10]。尤其是槲皮素的抗腫瘤作用引起人們的重視。張陽陽等[11]用槲皮素預(yù)處理MCF-7乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡作用，同時(shí)與阿霉素聯(lián)合運(yùn)用有協(xié)同化療效應(yīng)。師迎旭等[12]研究表明槲皮素可以有效提升阿霉素的抑制白血病細(xì)胞增殖的效率，對(duì)原代白血病細(xì)胞的增殖抑制具有協(xié)同和相加作用。已有報(bào)道證實(shí)，槲皮素對(duì)多種不同腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性，包括白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞等[13]。并且對(duì)多種抗癌藥物具有化療增敏作用，對(duì)放射也具有增敏作用，而相關(guān)的報(bào)道尚少。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于槲皮素標(biāo)記的金屬有機(jī)框架放療聯(lián)合阿霉素可以有效抑制宮頸癌的生長轉(zhuǎn)移同時(shí)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)下調(diào)，其治療效果明顯。因此，本研究認(rèn)為基于槲皮素標(biāo)記的金屬有機(jī)框架放療聯(lián)合阿霉素可以作為宮頸癌有效治療手段，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及阿霉素藥物化療的敏感性，從而增強(qiáng)其抗腫瘤效果，同時(shí)為其在宮頸癌治療中提供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。