HPLC法測定不同年生野山參中9種人參皂苷含量

楊懷雷，查 琳，王 影，徐芳菲，李 蕾，曹志強(qiáng)*

（吉林人參研究院·吉林通化·134001）

人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey的干燥根。以生態(tài)不同區(qū)分為野山參、移山參和園參[1]，在山野天然生長者被稱為野山參。野山參是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，其藥用歷史源遠(yuǎn)流長，具有大補(bǔ)元氣、生津、益肺、安神等功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明人參皂苷是其主要活性成分，故野山參中人參皂苷的含量可作為評價其內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。近年來，對于野山參的研究主要集中在鑒別、培育、指紋圖譜等方面[3～7]，對其人參皂苷含量研究較少[8]。本文采用高效液相色譜法對不同年生野山參中的9種人參單體皂苷成分進(jìn)行測定，為野山參的基礎(chǔ)成分研究提供了參考依據(jù)，可用于野山參的質(zhì)量評價和質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Ultimate 3000），美國賽默飛有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH-6），金壇市白塔金昌實驗儀器廠；電子天平（SQP），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料

野山參(5～18 年生)；人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（Fisher，USA），甲醇和正丁醇為分析純（北京化工廠）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 對照品適量， 制成人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 對 照 品 濃 度 分 別 為 0.1185、0.1290、0.1090、0.1160、0.1580、0.1160、0.1070、0.1345、0.1055 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取不同年生野山參于烘箱中（65℃）烘干，粉碎，過80目篩。精密稱取野山參粉末 （5～18年）0.5g，加10mL（20倍量）75%乙醇加熱回流2h，重復(fù)提取3次，合并濾液，蒸干。殘渣加10mL水溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再加10mL水飽和正丁醇萃取，重復(fù)萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸干。殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Thermo BDS HypersiL C18柱 (250 mm× 4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈-水（A-B），梯度洗脫，0～30 min(19%A)，30～35 min(19% ～24%A)，35～40 min(24%A)，40～55 min(24% ～28%A)，55～110 min(28% ～29%A)，110～130 min(29%～ 33%A)，110 ～ 130 min(29% ～ 33%A)，110 ～ 130 min(29% ～33%A)；流速為1.0mL/min；檢測波長為203 nm；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為5μL。

2.4 測定

精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品色譜圖中，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，顯示出保留時間相同的色譜峰，結(jié)果見圖1。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）色譜圖

Rg1；2.Re；3.Rf；4.Rb1；5.Rc；6.F1；7.Rb2；8.Rb3；9.Rd

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系

精密稱取人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 對照品適量， 制成人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 對 照 品 濃 度 分 別 為 1.0258、1.0473、0.3047、2.5086、1.0921、1.0546、0.8282、0.1391、0.2084 mg/mL的混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液 0.5、1.0，2.0、3.0、4.0、5.0mL 分別置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制出不同濃度的混合對照品溶液（1-6號）備用。精密吸取1號混合對照品溶液0.5ml置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得7號混合對照品溶液。分別精確吸取1-7號各濃度的混合對照品溶液5μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄峰面積。以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做回歸曲線，得到人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 回歸方程，詳見表 1。

表1 回歸方程

結(jié)果表明，各對照品回歸方程的相關(guān)系數(shù)均不小于 0.9995， 人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd分別在 0.1026～1.0258 mg/mL、0.1047～1.0473 mg/mL、0.0305 ～ 0.3047 mg/mL、0.2509 ～2.5086 mg/mL、0.1092 ～ 1.0921mg/mL、 0.0105 ～1.0546 mg/mL、0.0828 ～ 0.8282 mg/mL、0.0139 ～0.1391mg/mL和0.0208～0.2084mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度實驗

精密吸取混合對照品溶液5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。 測得人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和Rd峰面積的RSD （n=6） 分別為 0.76%、0.87%、0.96%、1.03%、0.98%、1.19%、0.58%、0.83%和1.37%，表明此方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗

精密吸取供試品溶液 5μL， 分別于 0、2、4、8、12和 24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 峰面積的 RSD 分別為 0.67%、0.92%、1.07%、0.51%、0.79%、1.26%、0.82%、1.49%和1.25 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性實驗

取5年生野山參樣品6份，精密稱定，按照“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份。精密吸取供試品溶液5μL進(jìn)樣，分別進(jìn)行測定。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 的含量平均值分 別 為 1.8546、2.0628、0.5849、3.5011、1.5447、0.4482、1.1539、0.2006 和 0.5494mg/g，RSD 值 分 別1.19%、1.02%、0.95%、1.42%、1.81%、1.77%、1.69%、1.91%和1.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率實驗

分別稱取已知含量的5年生野山參樣品粉末6份，每份0.25 g，每份分別加入適量人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 對照品溶液，按照“2.2”項下方法進(jìn)行制備，并按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算回收率。 結(jié)果（表 2）人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 對照品的平均回收率 （n=6） 分別為 98.08%、97.80%、96.80%、98.93%、99.22%、96.29%、98.01%、96.48%和98.95%?；厥章实腞SD值分別為 0.80%、0.76%、0.78%、0.62%、0.99%、0.89%、1.27%、1.10%和1.18%。實驗結(jié)果表明，各測定組分的平均加樣回收率均在95%～105%之間，加樣回收率良好。

表2 回收率實驗結(jié)果

2.6 樣品含量測定

分別取5～18年生野山參樣品，精密稱定，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液5μL，分別按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并根據(jù)外標(biāo)法計算各組分的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

本文比較了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-磷酸-水流動相體系，乙腈-水的分離效果最好。而加入磷酸對供試品中人參皂苷整體的分離度及峰形沒有顯著改善，且增加了色譜柱清洗難度，故最終確定乙腈-水為最佳流動相體系。本實驗采用一種梯度洗脫色譜條件實現(xiàn)了野山參中9種人參單體皂苷成分的同時測定，與文獻(xiàn)方法相比[9～10]，分離時間短，分離度良好，檢測效率高。

本實驗采用不同提取方法，超聲法和回流法對樣品中皂苷類成分進(jìn)行提取，結(jié)果顯示回流法提取的供試品溶液中皂苷含量相對較高，故采用回流法作為供試品溶液的制備方法。同時對不同提取溶劑進(jìn)行考察，包括甲醇、乙醇、75%乙醇、75%甲醇、水等，結(jié)果顯示75%乙醇和75%甲醇提取效果較好，提取皂苷類成分較多且分離度較好，測定時不會對待測成分造成干擾?？紤]到75%乙醇溶液安全性高，毒性小，且成本低廉，最終確定75%乙醇溶液為供試品的最佳提取溶劑。

本實驗同時對5～18年生野山參藥材中的9種皂苷類成分進(jìn)行了測定，經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，可以用于野山參的質(zhì)量控制，為野山參的有效成分基礎(chǔ)研究工作奠定了基礎(chǔ)，為野山參的藥理研究、質(zhì)量評價和質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。