改良四妙散顆粒對(duì)小鼠急性胰島素抵抗的影響

溫州市中醫(yī)院 浙江 溫州 325000

改良四妙散顆粒采用黃連、蒼術(shù)、黃柏和薏苡仁四味藥材，應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)制成顆粒劑。改良四妙散顆粒，是在古方四妙散（出自《成方便讀》）基礎(chǔ)上去牛膝加黃連而成，以加強(qiáng)清熱燥濕之力。具有清熱燥濕、健脾祛濁作用，用于治療2型糖尿?。═2DM）、胰島素抵抗（IR）屬濕熱困脾證者。同時(shí)現(xiàn)代藥理研究表明，黃連素具有與二甲雙胍相似的增加胰島素敏感性的作用[1]。對(duì)改良四妙散顆粒不同的處方配比進(jìn)行藥效學(xué)篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處方量為黃柏6份、蒼術(shù)10份、薏苡仁10份、黃連3份的改良四妙散顆粒改善急性胰島素抵抗效果最為顯著。

早期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，改良四妙散顆粒通過阻斷巨噬細(xì)胞中ERK/NF-κB信號(hào)通路來抑制炎癥反應(yīng)，表明改良四妙散顆粒具有抗炎活性[2]，其中主要活性成分是小檗堿[3]。后來進(jìn)一步證實(shí)了改良四妙散顆粒阻斷IKKβ/IRS-1/Akt信號(hào)途徑，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞中炎癥反應(yīng)并調(diào)節(jié)胰島素敏感性[4]。

炎癥學(xué)說認(rèn)為T2DM和IR是一種慢性炎癥性疾病，與炎癥因子，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等有密切的聯(lián)系。在諸多刺激中，細(xì)菌脂多糖（LPS）能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，LPS是內(nèi)毒素的主要成分，能刺激機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放大量的細(xì)胞因子，如一氧化碳（NO）、前列腺素、過氧化物，以及前炎癥因子類：TNF-α、IL-1β、IL-6等。TNF-α和IL-6均可致小鼠胰島素抵抗，而LPS刺激的巨噬細(xì)胞上清液含有大量的TNF-α和IL-6，所以我們采用這種方法造模。本實(shí)驗(yàn)研究的目的是考察改良四妙散顆粒改善急性胰島素抵抗的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物：改良四妙散顆粒，批號(hào)：101203，0.2082g浸膏粉相當(dāng)于1g生藥，每10g浸膏粉需加入220mg的揮發(fā)油包合物。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)劑量組，高劑量組：2.4g/kg，中劑量組：1.2g/kg，低劑量組：0.6g/kg。臨用前采用雙蒸水配置不同濃度的溶液供動(dòng)物灌胃用。

1.2 試劑：葡萄糖，批號(hào)：F20101115，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮試劑：0.01g蒽酮加0.2g硫脲溶于20ml的72%濃硫酸中，呈黃色透明溶液，儲(chǔ)存于棕色瓶中，4℃保存。4%磺基水楊酸：0.8g的磺基水楊酸溶于20ml的雙蒸水中。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀(Multiskan sPectrum)，型號(hào)1500，Thermo Electrom CorPoration；低溫離心機(jī)，型號(hào)1-15K，Sigma CorPoration；電子天平，TP114，丹佛儀器（北京）有限公司；全自動(dòng)純水儀（Water Purifica‐tion System），Hi-Tech Instruments CO.Ltd；DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱，型號(hào)3111，Thermo Electron CorPoration；XSZ-Dz倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；超低溫冰箱，型號(hào)702，Thermo Electron CorPoration。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康ICR種CL級(jí)雄性小鼠，體重18～22g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK(蘇)2007-0001，飼養(yǎng)于22±2℃的環(huán)境中，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，室內(nèi)采取12h光照、黑暗循環(huán)。

1.5 方法：分述如下。

1.5.1 LPS刺激巨噬細(xì)胞上清液的制備：從健康雄性小鼠提取巨噬細(xì)胞，細(xì)胞以6×105接于6孔培養(yǎng)板，4h細(xì)胞貼壁后換成無血清HG-DMEM培養(yǎng)，在每孔加入終濃度5μg/ml的LPS，48h后收集上清。收集的上清0.22μm濾膜過濾后貯存于-70℃超低溫冰箱中。注射用上清配制：取上述所收集上清按1∶2用生理鹽水稀釋為3倍。

1.5.2 改良四妙散顆粒對(duì)急性胰島素抵抗小鼠糖耐量的影響：將84只雄性CL級(jí)小鼠按體重隨機(jī)分成7組：空白組，模型組，改良四妙散顆粒高、中、低劑量組，二甲雙胍0.2g/kg組和消渴丸2g/kg組，每組12只。隔夜禁食不禁水12h后，毛細(xì)管眼球靜脈叢取血，此為0時(shí)，灌胃給藥，空白組和模型組灌胃給予雙蒸水0.1ml/10g，0.5h后腹腔注射LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞上清液0.2ml/只，0.5h后灌胃20%葡萄糖溶液0.1ml/10g體重，于0.5h、1.0h、2.0h取血，靜置15min，3000rPm，15min離心，吸取血清，用葡萄糖氧化酶法試劑盒測(cè)血糖。

1.5.3 改良四妙散顆粒對(duì)急性胰島素抵抗小鼠胰島素敏感指數(shù)（ISI）和肝糖原的影響：雄性CL級(jí)小鼠96只，按體重隨機(jī)分成8組：正常動(dòng)物組，空白組，模型組，改良四妙散顆粒高、中、低劑量組，二甲雙胍0.2g/kg組和消渴丸2g/kg組。小鼠過夜禁食12h后，灌胃給藥，正常動(dòng)物組、空白組、模型組灌胃雙蒸水0.1ml/10g，0.5h后除正常動(dòng)物組、空白組外，其他各組腹腔注射巨噬細(xì)胞上清液0.2ml/只，0.5h后灌胃20%的葡萄糖溶液0.1ml/10g，正常動(dòng)物組灌胃雙蒸水0.1ml/10g，于0.5h摘眼球取血，同時(shí)稱取0.2g的肝臟。①ISI的檢測(cè)：將血液離心，吸取血清，血糖（BG）、胰島素（INS）的檢測(cè)分別按照試劑盒說明書提供的方法測(cè)定。按文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)方法計(jì)算，計(jì)算公式為：ISI=Ln1/（INS×BG）胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=(INS×BG)/22.5。②肝糖原的檢測(cè)：將稱取的0.2g肝組織按重量∶體積=1∶9，用PBS制備勻漿；取勻漿0.5ml，加4%磺基水楊酸0.5ml，混勻，離心（1000rPm，20min）；取上清10μl，加到490μl蒽酮試劑中，沸水浴15min，冷卻，620nm測(cè)吸光度值（OD）。取肝臟勻漿液，12000rPm，離心20min，吸取上清用考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白含量。處理完畢后，以糖原/蛋白（mg/mg）表示糖原合成量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用student-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 改良四妙散顆粒對(duì)急性胰島素抵抗小鼠糖耐量的影響：0.5h時(shí)小鼠血糖達(dá)到峰值，模型組與空白組比較，血糖明顯升高(P＜0.05)，改良四妙散顆粒組與模型組比較，血糖明顯降低并呈劑量依賴性，二甲雙胍和消渴丸也明顯降低血糖，在1h時(shí)呈現(xiàn)一樣的情形，2h時(shí)血糖都恢復(fù)正常。說明改良四妙散顆粒能有效改善急性胰島素抵抗小鼠的糖耐量，并有劑量依賴性。見表1。

2.2 改良四妙散顆粒對(duì)急性胰島素抵抗小鼠ISI的影響：小鼠禁食12h后，灌胃給藥，0.5h后注射上清液，0.5h后灌胃20%的葡萄糖溶液0.1ml/10g，之后于0.5h摘眼球取血。血糖：除改良四妙散顆粒低劑量組外，中、高劑量組的小鼠血糖值明顯低于模型組（P＜0.05），二甲雙胍和消渴丸組也明顯降低血糖。胰島素：與正常動(dòng)物組比較，給糖空白組胰島素明顯升高，說明葡萄糖可以促進(jìn)胰島素的分泌；與空白組比較，模型組的胰島素顯著升高（P＜0.05）；改良四妙散顆粒（除低劑量組）中、高劑量組與模型組比較較明顯的降低（P＜0.05）；二甲雙胍和消渴丸具有相同的作用。胰島素敏感指數(shù)（ISI）：改良四妙散顆粒中、高劑量組明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05）；二甲雙胍和消渴丸也較明顯優(yōu)于模型組。HOMA-IR：與空白組比較，模型組顯著性升高（P＜0.05），說明小鼠的急性胰島素抵抗模型成功；與模型組比較，改良四妙散顆粒的中劑量、高劑量可以顯著性改善小鼠胰島素抵抗。二甲雙胍和消渴丸也明顯改善胰島素抵抗。見表2。

表1 改良四妙散顆粒對(duì)急性胰島素抵抗小鼠糖耐量的影響（±s）

表1 改良四妙散顆粒對(duì)急性胰島素抵抗小鼠糖耐量的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組二甲雙胍組消渴丸組血糖（mmol/L）2h 6.218±1.562 5.716±0.924 5.140±0.741 5.123±1.284 5.460±0.745 5.194±1.045 5.092±1.617例數(shù)12 12 12 12 12 12 12劑量（g/kg）——0.6 1.2 2.4 0.2 2 0h 4.500±0.678 4.808±0.958 4.419±0.472 4.804±0.530 4.111±0.418 4.893±0.737 4.465±1.066 0.5h 9.390±1.538*16.07±2.264 14.61±2.868 12.94±2.063*11.10±2.740*11.16±2.242*6.887±1.880*1h 7.071±1.029*11.09±1.182 9.495±1.958*8.550±1.046*8.264±1.813*7.480±1.193*4.588±1.228*

表2 改良四妙散顆粒對(duì)小鼠急性胰島素抵抗模型ISI的影響（±s）

表2 改良四妙散顆粒對(duì)小鼠急性胰島素抵抗模型ISI的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P＜0.05。

組別正常動(dòng)物組空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組二甲雙胍組消渴丸組HOMA-IR 15.90±2.89#38.49±4.97**66.31±11.40 61.28±12.04 51.59±11.12**42.31±9.39**38.37±6.44**30.60±7.41**例數(shù)12 12 12 12 12 12 12 12劑量（g/kg）— —0.6 1.2 2.4 0.2 2血糖（mmo/l）4.923±0.606#9.227±0.768**14.25±1.697 13.86±2.616 11.81±2.704*10.31±1.821**9.983±1.337**6.971±6.875**胰島素（Pmo/l）72.96±8.295#93.27±4.347**105.8±8.187 101.0±6.764 94.84±5.522*90.30±7.632**89.30±6.645**100.5±5.744 ISI-5.865±0.185#-6.729±0.136**-7.294±0.178-7.209±0.218**-7.036±0.220**-6.837±0.225**-6.748±0.171**-6.507±0.254**

2.3 改良四妙散顆粒對(duì)小鼠急性胰島素抵抗模型肝糖原的影響：小鼠禁食12.0h后，灌胃給藥0.5h后iP 0.2ml的巨噬細(xì)胞上清液，0.5h后ig給予2g/kg的葡萄糖，0.5h處死小鼠0.2g取肝組織。不同濃度的改良四妙散顆粒均能增加肝糖原的合成，并有劑量依賴性。其中劑量2.4g/kg的改良四妙散顆粒處理組與模型組相比，顯著增加肝糖原的合成。陽性對(duì)照組二甲雙胍（0.2g/kg）和消渴丸（2g/kg）亦能明顯的增加肝糖原的合成。見表3。

表3 改良四妙散顆粒對(duì)小鼠急性胰島素抵抗模型肝糖原的影響（±s）

表3 改良四妙散顆粒對(duì)小鼠急性胰島素抵抗模型肝糖原的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組二甲雙胍組消渴丸組肝糖原(mg/mg蛋白)0.245±0.065*0.181±0.046 0.196±0.055 0.240±0.072*0.292±0.068*0.303±0.090*0.267±0.085*例數(shù)12 12 12 12 12 12 12劑量（g/kg）— —0.6 1.2 2.4 0.2 2

3 討論

IR是T2DM發(fā)生和發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素,又是引起一系列代謝異常的重要原因，為此Reaven[5]于1988年提出了胰島素抵抗綜合征這一概念，認(rèn)為肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等諸多危險(xiǎn)因素與IR有關(guān)，之后，鑒于此綜合征與多種代謝相關(guān)疾病有密切的聯(lián)系，命名為代謝綜合征 (MS)或胰島素抵抗綜合征。早期研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖動(dòng)物模型脂肪細(xì)胞中TNF-α表達(dá)明顯增加，用可溶性的TNF-α受體中和TNF-α后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰島素抵抗有所減輕[6]。近期研究結(jié)果揭示，炎性刺激或脂肪顆粒在脂肪細(xì)胞的沉積促使脂肪細(xì)胞分泌較高水平的炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、γ干擾素（INF-γ）和抵抗素等，而這些炎性介質(zhì)可分別通過JNK和NF-κB兩條信號(hào)通路引發(fā)IR。IR是指機(jī)體對(duì)一定量的胰島素的生物學(xué)效應(yīng)低于預(yù)計(jì)正常水平的現(xiàn)象，表現(xiàn)為胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低，葡萄糖攝取減少和糖原合成減少。了解IR及其機(jī)制對(duì)于防治糖尿病有重要意義。

IR是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一。本研究結(jié)果表明，筆者采用炎性因子成功復(fù)制小鼠急性胰島素抵抗模型，改良四妙散顆粒能有效改善急性胰島素抵抗小鼠的糖耐量，并有劑量依賴性；除低劑量組外，中、高劑量組的小鼠血糖值明顯低于模型組（P＜0.05），且與模型組比較，明顯降低胰島素分泌（P＜0.05）；中、高劑量組的ISI明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05）；與模型組比較，改良四妙散顆粒的中劑量、高劑量可以顯著改善小鼠胰島素抵抗，并增加肝糖原的合成。綜上所述,改良四妙散顆?？梢愿纳菩∈蠹毙砸葝u素抵抗。