長(zhǎng)鏈非編碼RNA HCP5通過(guò)調(diào)控凋亡通路促進(jìn)三陰性乳腺癌的研究

仝 瀟 邢佳妮 王麗虹

乳腺癌的發(fā)病率位居我國(guó)女性惡性腫瘤之首，而占比10%～17%的三陰性乳腺癌(TNBC)更是由于缺乏治療靶點(diǎn)，而具有高侵襲性以及預(yù)后不良的特征[1]。因此，了解三陰性乳腺癌的發(fā)病機(jī)理，明確其疾病進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制對(duì)乳腺癌的預(yù)防和治療具有十分重要的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸但卻沒(méi)有蛋白編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄本[2]。最新的證據(jù)表明，lncRNA參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[3-4]。HCP5是HLA和P5的復(fù)合物，主要在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)，并在自身免疫中具有潛在作用[5]。最近的研究表明，HCP5在人類的一些癌癥中表達(dá)異常。HCP5是與HCV相關(guān)的肝細(xì)胞癌的易感性位點(diǎn)[6]，它也被認(rèn)為是肺腺癌的潛在生物標(biāo)志物[7]，但是在卵巢癌患者中卻顯著下調(diào)[8]。通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，我們發(fā)現(xiàn)HCP5與乳腺癌的預(yù)后息息相關(guān)[9]。然而，HCP5在TNBC中的作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)探討HCP5在TNBC中的表達(dá)、功能和調(diào)控機(jī)制，為尋找新的TNBC治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和臨床組織樣本

實(shí)驗(yàn)所需的人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A均由中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所提供。MCF-10A細(xì)胞系在F12/DMEM 1∶1的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。MCF-7細(xì)胞系在按比例加入0.01 mg/mL牛胰島素和0.11 mg/mL丙酮酸鈉的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。T47D和SK-BR-3細(xì)胞系使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上所有細(xì)胞系均使用10%胎牛血清(FBS)在37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。而MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-453細(xì)胞系則使用含10%胎牛血清(FBS)的L-15培養(yǎng)基，在37℃、無(wú)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所需的臨床組織樣本為2014—2015年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院提供，其中包括30例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(7例三陰、11例luminal A型、8例luminal B型和4例Her2+型)和30例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的癌旁正常乳腺組織。上述所有組織的提供者在術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療及免疫治療，亦未合并其他惡性腫瘤。實(shí)驗(yàn)方案也獲得了哈爾濱醫(yī)科大學(xué)人類研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 基因敲除和慢病毒轉(zhuǎn)染

將MDA-MB-231(1×105)和MDA-MB-468(2×105)細(xì)胞分別接種在6孔板中，24 h后使用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染50 nM的siRNA。將含有細(xì)胞的6孔板按照濃度梯度分別加入適量的慢病毒后再加入1/1 000的聚丁二烯增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效果。HCP5 siRNA的序列為5′-GCAGTGTGCTTCCTTCCTT-3′。陰性對(duì)照組(NC)siRNA序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.3 細(xì)胞RNA提取和熒光定量PCR

熒光定量PCR檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中HCP5 mRNA的相對(duì)表達(dá)。首先使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。提取出來(lái)的RNA用核酸測(cè)量?jī)x測(cè)量其濃度，其次利用ReverTra Ace-α qPCR RT試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用miRcute第一鏈cDNA合成試劑盒對(duì)成熟的miRNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。然后根據(jù)SYBR?Green RT-PCR試劑盒操作，在ABI 7500儀器上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參基因，所有樣品進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)性試驗(yàn)。本研究引物序列如下：HCP5-F：5′-GACTCTCCTACTGGTGCTTGGT-3′，HCP5-R：5′-CACTGCCTGGTGAGCCTGTT-3′；GAPDH-F：5′-CGTCACGGATTIGGTCG-3′，GAPDH-R：5′-TCICGCTCCIGAGGGGGAT-3′。最后用比較值2-△△CT法對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 RNA Scope實(shí)驗(yàn)

乳腺癌組織芯片北京中山金橋公司代為檢測(cè)。制備1×清洗緩沖液、復(fù)染試劑、脫水試劑，平衡試劑。在組織芯片上滴加探針，40℃以下雜交爐中2 h；用1×清洗緩沖液在室溫下清洗玻片2次，每次2 min；加入約4滴Amp 1，40℃以下雜交爐中30 min，用1×清洗緩沖液清洗，方法同上；加入約4滴Amp 1，40℃以下雜交爐中30 min，用1×清洗緩沖液在室溫下清洗玻片2次，每次2 min；加入約4滴Amp 2，40℃以下雜交爐中15 min，清洗同上；加入約4滴Amp 3，40℃以下雜交爐中30 min，清洗同上；加入約4滴Amp 4，40℃以下雜交爐中15 min，清洗同上；加入約4滴Amp 5，室溫孵育中30 min，清洗同上；加入約4滴Amp 6，室溫孵育中15 min，清洗同上；DAB染色室溫10 min，蒸餾水清洗兩次；50%蘇木精染色室溫2 min，蒸餾水清洗玻片3～5次；載玻片脫水，70% EtOH處理2 min，100% EtOH處理2 min，第二次100% EtOH處理2 min。二甲苯處理5 min；固定樣品，向每個(gè)載玻片上滴加1～2滴Cytoseal，蓋玻片蓋好，風(fēng)干載玻片。使用標(biāo)準(zhǔn)亮視野顯微鏡放大20～40倍觀察組織切片，評(píng)估陽(yáng)性對(duì)照強(qiáng)度和陰性對(duì)照背景。

1.5 細(xì)胞生存與毒性試驗(yàn)

使用Calcein-AM和ethidium homodimer(EthD-1)雙染法檢測(cè)活細(xì)胞和死細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染了HCP5 siRNA和對(duì)照siRNA的MDA-MB-231、MDA-MB-468細(xì)胞分別置于96孔板中，去除培養(yǎng)基，用PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次。并根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案制備分析試劑，在96孔板的每個(gè)孔中分別加入150 μL 的分析試劑。然后將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。用BERTHOLD的LB 942 TriStar2進(jìn)行檢測(cè)。用530 nm激發(fā)濾光片觀察到綠色的是活細(xì)胞，用645 nm激發(fā)濾光片觀察到紅色的為死細(xì)胞。最后根據(jù)說(shuō)明說(shuō)中的公式計(jì)算活細(xì)胞和死細(xì)胞的百分率。活細(xì)胞百分率=(F(530)sam-F(530)min/F(530)max-F(530)min)×100%；死細(xì)胞百分率=(F(645)sam-F(645)min/F(645)max-F(645)min)×100%。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染了HCP5 siRNA和對(duì)照siRNA的MDA-MB-231、MDA-MB-468細(xì)胞分別置于96孔板中，在37℃培養(yǎng)箱中分別孵育4 h、24 h、48 h、72 h后，在每孔中加入10 μL的CCK-8試劑。再置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)定表達(dá)LV10-sh-NC或LV10-sh-HCP5的MDA-MB-231細(xì)胞(8×106)和MDA-MB-468細(xì)胞(1×107)的細(xì)胞皮下注射到4周齡雌性BALBc裸鼠的背部皮下(每組6只)。每5天測(cè)量一次小鼠的腫瘤體積。30天后處死裸鼠，切除腫瘤組織，稱量瘤體重量，并用4%的多聚甲醛溶液固定。

1.8 抗體芯片

用轉(zhuǎn)染了HCP5 siRNA和對(duì)照siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行抗體芯片檢測(cè)。選擇RayBio C-Series人MAPK通路檢測(cè)試劑盒(AAH-MAPK-1)和凋亡檢測(cè)試劑盒(AAH-APO-1-2)，由RayBio公司提供檢測(cè)分析。首先將膜與生物素化檢測(cè)抗體混合物的孵育阻斷，然后再用HRP-偶聯(lián)的鏈霉親和素和檢測(cè)緩沖液進(jìn)行孵育。緊接著利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)圖像。最后，進(jìn)行密度測(cè)定和分析。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取其平均值。

1.9 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

從轉(zhuǎn)染了HCP5 siRNA和對(duì)照siRNA的MDA-MB-231、MDA-MB-468細(xì)胞中提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。用冷RIPA緩沖液與1% PMSF混合物裂解細(xì)胞，4℃，12 000×g離心30 min。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品的濃度。然后通過(guò)SDS-PAGE技術(shù)將每孔中等量的總蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。再在搖床上用5%的BSA室溫封閉膜1 h，TBST洗膜(3次/10 min)。洗好的膜用一抗(抗BIRC3抗體1∶500，抗Caspase-3抗體1∶500，抗β-actin 1∶2 500)孵育，4℃過(guò)夜。次日用TBST洗膜(3次/10 min)，洗好的膜在室溫下加入相應(yīng)的二抗(1∶10 000)孵育1 h。再用TBST洗膜3次，在膜上均勻加入超敏化學(xué)發(fā)光液(ECL)，用SageCaptureTM微型檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)并采用Lanc ID分析軟件計(jì)算相對(duì)密度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，TNBC細(xì)胞系與正常乳腺上皮細(xì)胞系及非TNBC細(xì)胞系多組間計(jì)量資料的比較，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCP5在TNBC細(xì)胞系和臨床樣本中的表達(dá)

與正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A和其他非TNBC細(xì)胞系MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-453相比，MDA MB-231和MDA-MB-468這兩種TNBC細(xì)胞系中的HCP5 mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05)(圖1A)。與30例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌癌旁正常組織以及其他亞型乳腺癌組織相比，HCP5 mRNA在TNBC中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。為了驗(yàn)證我們的結(jié)果，我們從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)下載了含有1 095個(gè)臨床浸潤(rùn)性乳腺癌樣本和113個(gè)非腫瘤乳腺組織數(shù)據(jù)，其中包含115個(gè)TNBC樣本。與非腫瘤乳腺組織以及TCGA數(shù)據(jù)集中的其他分子亞型相比，HCP5在基底樣乳腺癌中的表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)，但是HCP5的表達(dá)量在正常乳腺與未分型的乳腺癌兩組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1C)。

2.2 敲低HCP5對(duì)TNBC細(xì)胞凋亡和增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，與對(duì)照組MDA-MB-231 siNC和MDA-MB-468 siNC相比，MDA-MB-231 siHCP5和MDA-MB-468 siHCP5組細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.01)(圖2A)。細(xì)胞存活/死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組MDA-MB-231 siNC和MDA-MB-468 siNC相比，MDA-MB-231 siHCP5和MDA-MB-468 siHCP5組的細(xì)胞凋亡增加(P<0.01)(圖2B)。

2.3 敲低HCP5對(duì)TNBC細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響

用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法建立MDA-MB-231和MDA-MB-468的HCP5敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(MDA-MB-231-shNC、MDA-MB-231-shHCP5和MDA-MB-468-shNC、MDA-MB-468-shHCP5)，分別接種于裸鼠背部皮下。結(jié)果顯示，與MDA-MB-231-shNC和MDA-MB-468-shNC相比，MDA-MB-231-shHCP5和MDA-MB-468-shHCP5組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，腫瘤的重量明顯降低(P<0.01)(圖3A，C)，腫瘤的體積也明顯減小(P<0.01)(圖3B，D)。

2.4 HCP5調(diào)控TNBC進(jìn)展的途徑

采用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)了敲低HCP5的MDA-MB-231細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系中MAPK通路和凋亡通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，MAPK通路中兩組細(xì)胞系之間蛋白表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A)；而凋亡通路檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCP5穩(wěn)定敲低的細(xì)胞中，凋亡抑制因子BIRC3的表達(dá)顯著降低，Caspase-3的表達(dá)增加(P<0.05)(圖4B)。Western blot檢測(cè)的結(jié)果也顯示了相同的趨勢(shì)：在兩組細(xì)胞中，敲低HCP5的細(xì)胞BIRC3表達(dá)量下降，其下游因子Caspase-3表達(dá)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C)。

圖1 HCP5在乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of HCP5 in breast cancer cells and breast cancer tissuesNote：A.The expression of HCP5 was higher in TNBC cell lines than that in normal breast epithelial cell line MCF-10A and other breast cancer cell lines.*P<0.05，when compared with other cell lines；B.The RNA Scope detection showed that the expression of HCP5 was significantly up-regulated in TNBC tissues than that in adjacent normal tissues and other breast cancer subtype tissues(400×)；C.The expression of HCP5 was higher in basal-like breast cancers than that in normal breast tissues and other subtypes from the TCGA database.

圖2 敲低HCP5對(duì)TNBC細(xì)胞凋亡和增殖的影響Figure 2 Effect of knockdown HCP5 on apoptosis and proliferation of TNBC cellsNote：A.The CCK-8 assay was performed to measure the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05，**P<0.01；B.Knockdown HCP5 promoted apoptosis of MDA-MB-231 cells and MDA-MB-468 cells as shown by Calcein-AM/EthD-1 staining.Green：live cells，Red：dead or dying cell(400×).

圖3 敲低HCP5對(duì)TNBC細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響Figure 3 Effects of knockdown HCP5 on orthotopic tumor in nude miceNote：A.The representation picture and tumor weight of tumor formation of xenograft from lv10-sh-control and lv10-sh-HCP5 MDA-MB-231 cells in nude mice(n=6)；B.The summary for tumor volume was measured in nude mice every 5 days；C.The representation picture and tumor weight of tumor formation of xenograft in nude mice(n=6)；D.The summary for tumor volume was measured in mice every 5 days.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

圖4 HCP5調(diào)控TNBC進(jìn)展的途徑Figure 4 The mechanisms of HCP5 in the regulation of TNBC cellsNote：A.The MAPK antibody array showed no difference between wild and HCP5 knockdown MDA-MB-231 cells；B.The representative picture of APO antibody array showed an obviously decreased expression of BIRC3 and increased expression of caspase-3 in HCP5 knockdown MDA-MB-231 cells(n=3)；C.HCP5 knockdown decreased the expression of BIRC3 protein and increased the expression of Caspase-3 protein in MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05，when compared with the control group.

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害患者的身心健康[10]。同時(shí)在世界上大部分地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均居當(dāng)?shù)貗D女惡性腫瘤之首。而TNBC作為乳腺癌惡性程度最高的亞型，由于其致病機(jī)制的復(fù)雜性，缺乏有效的治療靶點(diǎn)，因此一直沒(méi)有較好的治療措施。

lncRNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中必不可少的調(diào)節(jié)因子[11-12]，在肝細(xì)胞癌、卵巢癌、肺腺癌等許多癌癥中人們發(fā)現(xiàn)了lncRNA HCP5的異常表達(dá)。然而，HCP5在乳腺癌中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究用qPCR和RNA Scope方法檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞系和臨床樣本中HCP5的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)HCP5在TNBC細(xì)胞系和臨床樣本中的表達(dá)量顯著升高。為了進(jìn)一步了解HCP5在TNBC中的作用機(jī)制，我們敲低了內(nèi)源性HCP5，發(fā)現(xiàn)敲低HCP5可以增加TNBC細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖和裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。因此，我們推測(cè)HCP5在TNBC中的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了腫瘤的惡性進(jìn)展。于是，我們通過(guò)抗體芯片對(duì)調(diào)控細(xì)胞增殖的MAPK通路和凋亡通路的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低HCP5時(shí)，MAPK通路蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著差異，但凋亡通路中的凋亡抑制因子BIRC3表達(dá)量下降，而其下游凋亡因子Caspase-3表達(dá)量增加，說(shuō)明細(xì)胞的凋亡過(guò)程與TNBC的進(jìn)展密切相關(guān)。已知BIRC3是一種典型的細(xì)胞凋亡抑制劑，它通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的存活，是許多癌癥的潛在致癌基因[13-14]。由此我們推測(cè)HCP5通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)TNBC惡性進(jìn)展，但其調(diào)控BIRC3及Caspase-3的確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，lncRNA HCP5在TNBC中顯著上調(diào)，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡通路促進(jìn)TNBC的惡性進(jìn)展。此外，我們的研究強(qiáng)調(diào)了HCP5的作用，并證明靶向HCP5可能是TNBC患者的一種有前途的治療策略。然而，HCP5能否作為治療TNBC的分子靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。