青藏高原地區(qū)的青楊遺傳多樣性研究

張 雨, 王久利, 夏銘澤, 張發(fā)起

(1. 中國(guó)科學(xué)院 高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所， 西寧 810001；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100039； 3. 青海民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院， 西寧 810007)

被稱為“世界屋脊”和地球“第三極”的青藏高原，是世界上海拔最高和面積最大的高原[1]。它是全球生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)之一，也是我國(guó)植物資源重要的“基因庫(kù)”。青楊隸屬于楊柳科楊屬，是我國(guó)特有的鄉(xiāng)土樹(shù)種[2]，它生長(zhǎng)迅速，材質(zhì)優(yōu)良，并且能較好地適應(yīng)潮濕和寒冷的環(huán)境，對(duì)生態(tài)保護(hù)和環(huán)境恢復(fù)有著重要的價(jià)值[3]。青藏高原是青楊的主要分布區(qū)之一，擁有豐富而獨(dú)特的楊樹(shù)資源，為楊樹(shù)的選育提供了有利條件[4-5]。

目前已有研究表明，分布在青藏高原東緣的青楊群體受到地理和空間的大尺度隔離，產(chǎn)生了基因流的隔離，具有中等偏上的遺傳多樣性水平[6]。利用葉綠體DNA序列開(kāi)展譜系地理學(xué)研究，通過(guò)描述物種現(xiàn)存遺傳分布格局和譜系關(guān)系可推測(cè)物種的冰期進(jìn)化歷史，揭示氣候和環(huán)境變化對(duì)其生物地理分布格局的影響[7]。但當(dāng)前研究?jī)H利用ISSR和SSR開(kāi)展遺傳分析，并沒(méi)有采用包含更豐富歷史演化信息的分子標(biāo)記(如cpDNA)，對(duì)青楊的遺傳多樣性和歷史演化分析是不完整的[6]。因此，本文選取cpDNA非編碼區(qū)atpH-atpI和rbcL片段開(kāi)展青楊的譜系地理學(xué)研究，分析該區(qū)域青楊的群體遺傳結(jié)構(gòu)和居群歷史動(dòng)態(tài)，揭示青楊在第四紀(jì)冰期的演化歷史和現(xiàn)今生物地理分布格局的成因，為青楊的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳保護(hù)策略的制訂等提供科學(xué)依據(jù)，并豐富對(duì)青藏高原地區(qū)生物演化歷史的理解。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料采自青藏高原及其毗鄰地區(qū)，共14個(gè)居群202個(gè)個(gè)體(表1)。此外，選取垂柳(SalixbabylonicaL.；憑證號(hào)Chen2015601，101°45′N，36°37′E，海拔2290 m)作為外類群。采集生長(zhǎng)良好的幼嫩葉片裝入DNA材料袋后置于硅膠中干燥，并帶回實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。憑證標(biāo)本存于青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)。

表1 青楊居群采集信息

1.2 基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

青楊基因組DNA采用N96植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)提取。采用葉綠體DNA通用引物對(duì)所有個(gè)體的atpH-atpI和rbcL片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8-9]。PCR反應(yīng)體系為50 μL：5.0 μL的10×PCR Buffer(含1.5 mmol/L MgCl2)，0.5 μL 10 mmol/L dNTP，正向和反向引物各2.0 μL(5 pmol/L)，DNA聚合酶(TaKaRa，大連)2 μL，20～45 ng模板，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃加熱變性70 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳檢測(cè)，用ABI 3730xl型基因測(cè)序儀(Applied Biosystems，加拿大)正反向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用CLUSTAL X和Sequencher v 5.4(http://www.genecodes.com)對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行對(duì)位排列，并進(jìn)行手工校正[10]。DNA序列的堿基組成由MEGA 6.0.4軟件統(tǒng)計(jì)。通過(guò)DnaSP V 5[11]統(tǒng)計(jì)cpDNA聯(lián)合序列的變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，并確定單倍型。在Arlequin軟件包中，分別計(jì)算單倍型多樣性(He)、核苷酸多樣性(π)和中性檢驗(yàn)中的Tajima′s D，并完成歧點(diǎn)分布分析。運(yùn)用PERMUT軟件計(jì)算居群內(nèi)平均遺傳多樣性(hs)、總遺傳多樣性(ht)、居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)和(Nst)，并用U-統(tǒng)計(jì)方法對(duì)Gst和Nst進(jìn)行1000次重復(fù)置換檢測(cè)。通過(guò)Arlequin軟件包中的分子變異分析(AMOVA)檢測(cè)青楊的遺傳變異水平(居群內(nèi)/間)，并對(duì)單倍型分布的固定指數(shù)Fst進(jìn)行1000次重復(fù)置換檢測(cè)評(píng)價(jià)[12]。以垂柳作為外類群，利用PAUP*4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)演化樹(shù)[13]。單倍型之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系通過(guò)軟件NETWORK以最大簡(jiǎn)約法為原則構(gòu)建單倍型中央連接網(wǎng)狀圖[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

青楊所有個(gè)體的atpH-atpI和rbcL片段經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序后，利用CLUSTAL X軟件對(duì)位排列后的長(zhǎng)度為1514 bp，共鑒定出13個(gè)單倍型(H1-H13；GenBank注冊(cè)號(hào)：KU663538-KU663554)。其中，單倍型H2出現(xiàn)的頻率最高，有82個(gè)個(gè)體檢測(cè)出該單倍型，居群YY、LJ、XG、GH和ND等都僅檢測(cè)到這種唯一單倍型(表 2)。

表2 青楊14個(gè)居群的單倍型組成、單倍型多樣性和核苷酸多樣性

2.2 居群遺傳結(jié)構(gòu)特征

基于cpDNA聯(lián)合序列13個(gè)單倍型的PERMUT分析顯示，居群內(nèi)平均遺傳多樣性Hs為0.255，總遺傳多樣性Ht為0.814。而居群間遺傳分化系數(shù)Nst(0.662)

表3 基于2個(gè)cpDNA片段13種單倍型對(duì)青楊15個(gè)居群的分子變異分析結(jié)果

2.3 居群歷史動(dòng)態(tài)

利用atpH-atpI及rbcL片段對(duì)青楊的202個(gè)個(gè)體進(jìn)行歧點(diǎn)分布分析后，得到的分布曲線為多峰曲線(圖1)，與快速擴(kuò)張模型相悖，說(shuō)明在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)居群沒(méi)有發(fā)生近期快速擴(kuò)張，處于一種比較穩(wěn)定的狀態(tài)，中性檢驗(yàn)的結(jié)果[Tajima′sD=-0.443 86(P>0.10)]不顯著，符合中性假說(shuō)，因此也支持歧點(diǎn)分布分析得出的結(jié)論。

圖1 青楊cpDNA聯(lián)合片段202株個(gè)體進(jìn)行歧點(diǎn)分布分析的結(jié)果

2.4 單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

從最大簡(jiǎn)約樹(shù)可看出青楊14個(gè)居群的13個(gè)單倍型分化為3個(gè)主要分支(圖2)：?jiǎn)伪缎虷12、H13構(gòu)成第一分支，分別固定于ND、LT這兩個(gè)居群中；分支二包括單倍型H1、H10、H2、H8、H7和H9，固定在LH、YY、LJ、XG、DL、GH、XRD、HL、YS及GD這10個(gè)居群之中；分支三包括單倍型H11、H6、H3、H5和H4，其中H11、H6構(gòu)成一個(gè)小的分支，分別固定在居群ND、LT中，而單倍型H3、H5及H4聚為另外一個(gè)小分支，共同固定在HY居群中，且此兩個(gè)小分支的支持率較高(分別為92%和99%)。單倍型網(wǎng)狀關(guān)系圖(圖3)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)類似，該圖主要以單倍型H2為中心形成了發(fā)散狀的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，但是比系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)所示結(jié)果更加清晰明了。

圖2 青楊cpDNA聯(lián)合序列13個(gè)單倍型最大簡(jiǎn)約法分析結(jié)果

圖3 青楊cpDNA聯(lián)合序列13個(gè)單倍型中央連接網(wǎng)狀圖

3 討論與結(jié)論

3.1 遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

與青藏高原地區(qū)多種植物的研究結(jié)果一致[15-18]，青楊也呈現(xiàn)為較高的總遺傳多樣性和較低的居群內(nèi)平均遺傳多樣性(Ht=0.814；Hs=0.255)。這表明葉綠體基因組在各個(gè)居群之間分化較為明顯，且絕大多數(shù)居群內(nèi)的單倍型較為單一。在青楊14個(gè)居群中，有8個(gè)居群只有一種單倍型，另外6個(gè)居群表現(xiàn)出單倍型多態(tài)性。此外，居群間遺傳分化系數(shù)Nst(0.662)

3.2 冰期避難所

近年來(lái)青藏高原地區(qū)的植物譜系地理學(xué)研究主要呈現(xiàn)出兩種不同的譜系地理模式，一是“邊緣避難所”模式，即冰期高原臺(tái)面的種群退縮到高原邊緣的避難所，其中祁連圓柏(Juniperusprzewalskii)[21]、瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)[22]、長(zhǎng)花馬先蒿(Pedicularislongiflora)[23]等植物均符合該模式。另一種是“微型避難所”模式，冰期高原面的種群退縮到微型避難所(或本地避難所)，其中海仙報(bào)春(Primulapoissonii)[16]、西藏圓柏(Sabinatibetica)[24]、露蕊烏頭(Aconitumgymnandrum)[25]等植物符合該模式。在邊緣避難所模式中，植物的遺傳多樣性水平一般呈現(xiàn)從高原邊緣向高原臺(tái)面遞減的趨勢(shì)[21]，青楊的遺傳分布模式顯然不符。青楊遺傳多樣性和核苷酸多態(tài)性較高的居群零星分布于本研究區(qū)域，且特有單倍型的分布也是如此，遺傳分布和地理分布之間沒(méi)有顯著相關(guān)性，這可能是由于在研究區(qū)域內(nèi)存在多個(gè)微型避難所所致。遺傳多樣性較高居群如LH、HY、DL、HL、GD和XRD，主要分布在祁連山脈和橫斷山脈地區(qū)，這兩個(gè)地區(qū)可能是青楊的冰期微型避難所，其中橫斷山區(qū)也是青藏高原很多植物的重要避難所，是冰期后植物物種回遷和擴(kuò)散的發(fā)源中心[26]。第四紀(jì)末次冰期后青藏高原地區(qū)的氣候和地質(zhì)條件相對(duì)穩(wěn)定，有利于種群從避難所向周邊區(qū)域擴(kuò)散，然而青楊種群主要分布于唐古拉山脈、祁連山脈和橫斷山脈等地形、地勢(shì)復(fù)雜的高山地區(qū)，導(dǎo)致種群擴(kuò)散受限，基因流水平也較低(Nm=0.12)。