長鏈非編碼RNA DLX6-AS1 調(diào)控微小RNA-15b 和磷脂酶D1 影響口腔鱗狀細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究

楊利杰， 田欣欣， 管臻潔

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，河南 鄭州 450002）

口腔鱗狀細(xì)胞癌簡稱口腔鱗癌，占口腔頜面部惡性腫瘤的80%[1]， 其較高的發(fā)病率嚴(yán)重威脅人類生命健康。 口腔鱗癌常發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，多為局部復(fù)發(fā)，因此治療效果不佳[2]。 探討口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制并尋找治療靶點(diǎn)是當(dāng)前口腔醫(yī)生的重要任務(wù)。 長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類小分子單鏈非編碼RNA，其可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)與微小RNA （miRNA） 相互作用調(diào)控miRNA 靶基因的表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。 生長停滯特異性蛋白6-反義RNA1（DLX6-AS1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其在非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，降低其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[4-6]。 但DLX6-AS1 在口腔鱗癌中的表達(dá)及其對口腔鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，目前還未知。 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-15b 可能是DLX6-AS1的靶基因，DLX6-AS1 可能作為miR-15b 的內(nèi)源性RNA 調(diào)控miR-15b 靶基因的表達(dá)。 有報(bào)道稱，miR-15b 在口腔鱗癌組織中表達(dá)降低， 過表達(dá)miR-15b可抑制口腔鱗癌細(xì)胞Cal27 增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在口腔鱗癌中發(fā)揮抑癌基因作用[7]。 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，磷脂酶D1（PLD1）是miR-15b 的靶基因。 磷脂酶可將磷脂酰膽堿水解生成磷脂酸和膽堿，影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生理功能[8]。 研究顯示，PLD1 可促進(jìn)胰腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9-11]，但其在口腔鱗癌中的作用還未知。 本研究以miR-15b/PLD1 軸為切入點(diǎn)，深入探討DLX6-AS1 對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、 遷移和侵襲的影響，以期為該腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的闡明及治療靶點(diǎn)的選擇提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2016 年12 月—2018 年5 月于本院確診并進(jìn)行手術(shù)治療的38 例口腔鱗癌患者的癌組織和對應(yīng)的癌旁組織，液氮保存，其中癌旁組織距離癌組織邊緣＞3 cm，病理檢測未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。38 例患者中男性25 例，女性13 例，年齡47～72 歲，平均年齡（65.29±5.78）歲。 TNM 分期：Ⅰ期9 例，Ⅱ期11 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期8 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16 例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移22 例。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行放、化療等治療的患者；②心臟、腎等重要器官功能不全者；③臨床資料不完整的病例；④患有免疫系統(tǒng)疾病者。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者或其家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑

口腔鱗癌細(xì)胞HSC3 （中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）， 四甲基噻唑藍(lán)（MTT）和胰蛋白酶 （美國Sigma 公司），LipofectamineTM 2000 試劑盒和TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR 引物（昆明擎科生物科技有限公司），兔抗人p21、MMP-2、E-cadherin 及PLD1 多克隆 抗體（美國Santa Cruz 公司），雙熒光素酶活性檢測試劑盒（美國Promega 公司），DLX6-AS1 小干擾RNA、亂序無意義陰性序列、miR-15b 模擬物、miR-15b 抑制劑及陰性序列、PLD1 過表達(dá)載體及熒光素酶報(bào)告載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HSC3 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HSC3 細(xì)胞， 將其培養(yǎng)于含10 % FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中， 并置于37 ℃、5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。 當(dāng)培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，0.25%胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 調(diào)整對數(shù)增殖期HSC3 細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/mL， 以每孔2.5 mL 的量接種于6 孔板中。 待細(xì)胞融合至60%時(shí)， 參照LipofectamineTM 2000 試劑盒說明書，分別轉(zhuǎn)染DLX6-AS1小干擾RNA（si-DLX6-AS1 組）、亂序無意義陰性序列 （si-NC 組）、DLX6-AS1 過表達(dá)載體（pcDNA3.1-DLX6-AS1 組）、空載體（pcDNA3.1 組）、miR-15b 模擬物（miR-15b 組）、模擬物對照（miR-NC 組）、miR-15b 抑制劑 （anti-miR-15b 組）、 抑制劑對照（antimiR-NC 組）， 共 轉(zhuǎn) 染DLX6-AS1 小 干 擾RNA 與miR-15b 抑制劑 （si-DLX6-AS1+anti-miR-15b 組）、DLX6-AS1 小干擾RNA 與抑制劑陰性對照（si-DLX6-AS1 +anti-miR-NC 組）、DLX6-AS1 小 干 擾RNA 與PLD1 過表達(dá)載體（si-DLX6-AS1+pcDNA3.1-PLD1 組）、DLX6-AS1 小 干 擾RNA 與 空 載 體（si-DLX6-AS1+pcDNA3.1 組）至HSC3 細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 RT-qPCR 檢測DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1 mRNA 表達(dá)水平 應(yīng)用TRIzol 試劑提取口腔鱗癌組織或細(xì)胞中總RNA， 微量核酸儀檢測RNA 濃度和純度后， 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其合成為cDNA。 然后以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。 DLX6-AS1上游引物：5′-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3′，下游引 物：5′-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3′；miR-15b上 游 引 物：5′-ACACTCCAGCTGGGTTAGCAGCACATCAT-3′，下游引物：5′-CACAGCTCGTAGAACAG GAGG-3′；PLD1 上游引物：5′-GAGCCACGGGTAAA TACCTCT-3′， 下游引物：5′-CCGCGTGTCCAGATT TTCTATG-3′；GAPDH 上 游 引 物：5′-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′， 下游引物：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3′；U6 上 游 引 物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′ ， 下 游 引 物：5′ -ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)。 DLX6-AS1 和PLD1 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-15b 以U6 為內(nèi)參， 采用2-△△Ct法計(jì)算DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1 mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.3.4 MTT 法檢測HSC3 細(xì)胞增殖 調(diào)整各組轉(zhuǎn)染后的HSC3 細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/mL，以每孔200 μL 的量接種于96 孔板中， 每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后，加入20 μL 的MTT（5 g/L），繼續(xù)孵育4 h。 取出培養(yǎng)板，將培養(yǎng)基吸棄后每孔加入150 μL的二甲基亞砜，振蕩混勻，于酶標(biāo)儀490 nm 處測定吸光度值。細(xì)胞存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.5 Transwell 檢測HSC3 細(xì)胞遷移和侵襲 用不含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整各組轉(zhuǎn)染后的HSC3 細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。 遷移實(shí)驗(yàn)中，在Transwell 上室中直接加入100 μL 細(xì)胞懸液， 在下室中加入500 μL 含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基。 侵襲實(shí)驗(yàn)中， 先在Transwell 上室鋪設(shè)Matrigel 基質(zhì)膠， 然后加入100 μL 細(xì)胞懸液， 下室加入500 μL含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基。 培養(yǎng)48 h 后，吸棄培養(yǎng)基，取出上室。 經(jīng)4 %多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，棉簽擦去未穿膜細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，對穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.6 Western Blot 檢測HSC3 細(xì)胞中p21、MMP-2、E-cadherin 和PLD1 蛋白表達(dá) 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞。 加入RIPA 蛋白裂解液，置于冰上充分裂解30 min，提取細(xì)胞中總蛋白。 用BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度并進(jìn)行定量。 取適量蛋白溶液，100 ℃煮沸5 min，變性后，以每泳道30 μg 上樣量行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。 電泳后，將分離的蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜， 并于5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h。 分別加入p21 （稀釋度1∶800）、MMP-2 （稀釋度1∶1 000）、Ecadherin（稀釋度1∶600）和PLD1（稀釋度1∶800）抗體，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度1∶200），37 ℃下孵育1 h。 滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影液，避光顯影后，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-15b 與DLX6-AS1 和核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，PLD1 的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR） 存在與miR-15b 結(jié)合的核苷酸序列。 PCR 分別擴(kuò)增含miR-15b 結(jié)合位點(diǎn)的DLX6-AS1 序列及PLD1 的3′UTR 序列， 并通過基因定點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變， 分別構(gòu)建DLX6-AS1 野生型（WT-DLX6-AS1）、突變型（MUT-DLX6-AS1）和PLD1 野生型（WT-PLD1）、突變型（MUT-PLD1）熒光素酶載體。 分別將熒光素酶載體與miR-15b 模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至HSC3 細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染24 h 后，收集各組細(xì)胞。 參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測各組的熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔鱗癌組織中DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1的表達(dá)水平

與癌旁組織比較， 口腔鱗癌組織中DLX6-AS1和PLD1 mRNA 表達(dá)水平升高 （P＜0.001），miR-15b表達(dá)水平降低（P＜0.001）。TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期的口腔鱗癌組織中的DLX6-AS1 表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅱ期口腔鱗癌組織（P＜0.001），而miR-15b 的表達(dá)水平低于Ⅰ～Ⅱ期口腔鱗癌組織（P＜0.001）。 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者口腔鱗癌組織中的DLX6-AS1 表達(dá)水平高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的口腔鱗癌組織（P＜0.001），而miR-15b 表達(dá)水平低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者口腔鱗癌組織（P＜0.001）。 詳見表1、圖1。

2.2 抑制DLX6-AS1 表達(dá)對HSC3 細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響

si-DLX6-AS1 組HSC3 細(xì)胞DLX6-AS1 表 達(dá) 水平低于si-NC 組（P＜0.001），表明DLX6-AS1 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染成功，HSC3 細(xì)胞中DLX6-AS1 表達(dá)受到抑制。 與si-NC 組比較，si-DLX6-AS1 組HSC3 細(xì)胞存活率、遷移和侵襲數(shù)及MMP-2 蛋白水平降低（P＜0.001），p21 和E-cadherin 蛋白水平升高（P＜0.001）。詳見圖2。

表1 DLX6-AS1、miR-15b 與臨床分期及轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系Table 1 Relationship between DLX6-AS1, miR-15b and clinical stage and metastasis

圖1 口腔鱗癌組織中DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1 mRNA 的表達(dá)水平Figure 1 Expression level of DLX6-AS1, miR-15b and PLD1 mRNA in oral squamous cell carcinoma

2.3 DLX6-AS1 靶向負(fù)調(diào)控miR-15b

生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，DLX6-AS1 與miR-15b 的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)。 雙熒光素酶活性檢測顯示，miR-15b 模擬物可降低WT-DLX6-AS1 載體的熒光素酶活性（P＜0.001）， 對MUT-DLX6-AS1載體的熒光素酶活性無顯著影響（P＞0.05）。 pcDNA3.1-DLX6-AS1 組miR-15b 表達(dá)水平低于pcDNA3.1 組（P＜0.001），si-DLX6-AS1 組miR-15b 表達(dá)水平高于si-NC 組（P＜0.001）。 詳見圖3。

2.4 抑制miR-15b 表達(dá)降低抑制DLX6-AS1 對HSC3 細(xì)胞活性、遷移和侵襲的抑制作用

與si-DLX6-AS1+anti-miR-NC 組比較，si-DLX6-AS1+anti-miR-15b 組HSC3 細(xì)胞存活率、 遷移和侵襲數(shù)及MMP-2 蛋白表達(dá)水平升高 （P＜0.001），miR-15b 及p21、E-cadherin 蛋 白 表 達(dá) 水 平 降 低 （P＜0.001）。 詳見圖4。

2.5 過表達(dá)PLD1 降低抑制DLX6-AS1 對HSC3 細(xì)胞活性、遷移和侵襲的抑制作用

與si-DLX6-AS1+pcDNA3.1 組比較，si-DLX6-AS1+pcDNA3.1-PLD1 組HSC3 細(xì)胞存活率、遷移和侵襲數(shù)及PLD1、MMP-2 蛋白 表達(dá)水平 升高 （P＜0.001），p21 和E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低 （P＜0.001）。 詳見圖5。

2.6 miR-15b 靶向負(fù)調(diào)控PLD1 表達(dá)

生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，PLD1 的3′UTR 與miR-15b 的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)。 雙熒光素酶活性檢測顯示，miR-15b 模擬物可降低WT-PLD1 載體的熒光素酶活性（P＜0.001），對MUT-PLD1 載體的熒光素酶活性無顯著影響（P＞0.05）。 miR-15b 組PLD1 的mRNA 和蛋白水平低于miR-NC 組 （P＜0.001），anti-miR-15b 組PLD1 的mRNA 和 蛋 白 水 平高于anti-miR-NC 組（P＜0.001）。 詳見圖6。

圖2 抑制DLX6-AS1 對HSC3 細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移和侵襲及p21、E-cadherin 和MMP-2 蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Inhibition of DLX6-AS1 on the cell activity, migration and invasion of HSC3 cells, and the expression of p21, E-cadherin andMMP-2

圖3 DLX6-AS1 靶向調(diào)控miR-15bFigure 3 DLX6-AS1 targeting regulation miR-15b

3 討論

圖4 抑制miR-15b 表達(dá)降低抑制DLX6-AS1 對HSC3 細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移、侵襲及p21、E-cadherin 和MMP-2 蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Inhibition of miR-15b reduces the effect of inhibition of DLX6-AS1 on cell activity, migration, invasion and expression of p21,E-cadherin and MMP-2 in HSC3 cells

圖5 過表達(dá)PLD1 能減弱抑制DLX6-AS1 對HSC3 細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移、侵襲及p21、E-cadherin 和MMP-2 蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Overexpression of PLD1 attenuates the inhibition of DLX6-AS1 on cell activity, migration, invasion and expression of p21, Ecadherin and MMP-2 in HSC3 cells

圖6 MiR-15b 靶向調(diào)控PLD1Figure 6 MiR-15b targeting PLD1

近年來，lncRNA 在腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注。 DLX6-AS1 是一種新型lncRNA。 Fang 等[12]的研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中DXL6-AS1 表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)通過介導(dǎo)miR-223 基因沉默而上調(diào)HSP90B1 蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進(jìn)膀胱癌發(fā)展。 Liang 等[13]的研究顯示，DLX6-AS1 在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)， 其高表達(dá)與腫瘤T3、T4 期的侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)。 DLX6-AS1 通過與miR-204-5p 結(jié)合并上調(diào)蛋白表達(dá)，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化， 是潛在的胃癌預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。 目前，DLX6-AS1 對口腔鱗癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響還未知。

本研究顯示， 口腔鱗癌組織中DLX6-AS1 表達(dá)水平升高， 且其表達(dá)與患者TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)， 提示DLX6-AS1 可能參與口腔鱗癌的發(fā)生與發(fā)展。轉(zhuǎn)染DLX6-AS1 小干擾RNA 至口腔鱗癌細(xì)胞HSC3 后的結(jié)果顯示， 抑制DLX6-AS1表達(dá)后，HSC3 的細(xì)胞存活率及遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)降低， 提示抑制DLX6-AS1 表達(dá)可抑制HSC3 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，是降低口腔鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在分子靶點(diǎn)。p21 是腫瘤抑制因子，參與細(xì)胞周期的調(diào)控， 其表達(dá)增加可抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14]。MMP-2 可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[15]。 E-cadherin 是黏附因子，其表達(dá)降低或缺失能使細(xì)胞獲得侵襲性表型[16]。本研究顯示，抑制DLX6-AS1 表達(dá)后，HSC3 細(xì)胞中MMP-2 蛋白表達(dá)降低，而p21 和E-cadherin 蛋白表達(dá)升高，提示抑制DLX6-AS1 表達(dá)通過下調(diào)MMP-2 蛋白表達(dá)和上調(diào)p21、E-cadherin 蛋白表達(dá)而抑制HSC3 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-15b 可能是DLX6-AS1 的靶基因。 本研究通過雙熒光素酶活性報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DLX6-AS1 可與miR-15b 的核苷酸序列靶向結(jié)合。 此外，上調(diào)HSC3 細(xì)胞中DLX6-AS1表達(dá)后，miR-15b 表達(dá)降低，而下調(diào)DLX6-AS1 表達(dá)后，miR-15b 表達(dá)升高，提示DLX6-AS1 在HSC3 細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控miR-15b。 本研究還顯示，miR-15b在口腔鱗癌組織中表達(dá)降低，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致[7]。抑制miR-15b 表達(dá)降低了抑制DLX6-AS1 表達(dá)對HSC3 細(xì)胞增殖、 遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響， 提示DLX6-AS1 通過靶向上調(diào)miR-15b 表達(dá)發(fā)揮抗口腔鱗癌作用。

為了進(jìn)一步探究DLX6-AS1 靶向調(diào)控miR-15b表達(dá)抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用機(jī)制， 本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測， 結(jié)果顯示PLD1 是miR-15b 的靶基因。 PLD1 參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為。 如Kang 等[17]的研究顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞中PLD1 表達(dá)升高，抑制PLD1表達(dá)， 通過抑制Wnt/β-catenin 和PI3K 信號(hào)通路的激活降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，是結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)。目前，還未見PLD1 影響口腔鱗癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的相關(guān)報(bào)道。 本研究顯示，口腔鱗癌組織中PLD1 mRNA 表達(dá)水平升高， 提示其在該腫瘤中也發(fā)揮促癌基因作用。 本研究還顯示，miR-15b 靶向負(fù)調(diào)控PLD1，過表達(dá)PLD1 降低了抑制DLX6-AS1 表達(dá)對HSC3 細(xì)胞增殖、 遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，提示DLX6-AS1 作為miR-15b 的內(nèi)源性RNA 與miR-15b 相互作用，通過下調(diào)PLD1 表達(dá)抑制口腔鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。 然而，DLX6-AS1 下游靶miRNA 及miR-15b 下游靶mRNA 眾多，進(jìn)一步研究DLX6-AS1 下游miRNA/mRNA 通路是下一步的重點(diǎn)。

綜上所述， 口腔鱗癌組織中DLX6-AS1 呈高表達(dá)， 抑制DLX6-AS1 表達(dá)可降低口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其可能通過與miR-15b 相互作用進(jìn)而下調(diào)PLD1 表達(dá)發(fā)揮作用，為口腔鱗癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的闡明及治療靶點(diǎn)的選擇提供了新思路。