鈣粘蛋白11 在頭頸部鱗癌中相關(guān)作用的研究

沈禹辰， 劉苗苗， 李建豪， 夏燕云， 李吉辰， 樸松林

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江 哈爾濱 150001）

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）簡稱頭頸部鱗癌，是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤， 且發(fā)病率逐年上升。 Bray 等[1]于2018 年統(tǒng)計的癌癥報告顯示，HNSCC 全球發(fā)病人數(shù)約355 000 例， 死亡人數(shù)約177 000 例， 在美拉尼西亞的發(fā)病率最高。 誘發(fā)HNSCC 的原因眾多，包括遺傳傾向、化學(xué)制劑、輻射、吸煙、飲酒等[2]。 在過去的30 年里，盡管HNSCC 的治療有了很大的改善， 但5 年生存率仍然很低，僅為50%~55%[1]。 因此，尋找HNSCC 發(fā)生、發(fā)展的潛在影響因子，幫助預(yù)測腫瘤行為和指導(dǎo)治療是亟須解決的難題。

鈣粘蛋白11（CDH11），也稱成骨細(xì)胞鈣粘蛋白，是一種Ⅱ型經(jīng)典鈣粘蛋白，其首次在成骨細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)， 是一種參與細(xì)胞-細(xì)胞粘附的完整膜蛋白，可能在骨的發(fā)育和維持中發(fā)揮作用[3]。 有研究表明，CDH11 在前列腺癌和乳腺癌中促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移，尤其是在乳腺癌中， 由于癌細(xì)胞對高度表達(dá)CDH11的成骨細(xì)胞的高親和力， 使CDH11 促進(jìn)癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移[4-5]。 然而在食管癌、結(jié)直腸癌和胃癌中，CDH11 被甲基化沉默，并具有抑癌作用，能抑制食管癌和鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移[6-7]。 由于CDH11功能的差異性，在研究其對腫瘤發(fā)展過程中的影響時，需充分考慮細(xì)胞環(huán)境因素。 由于CDH11 在口腔鱗癌中的表達(dá)與功能尚不明確，所以本研究旨在通過選擇性地對CDH11 進(jìn)行沉默，檢測HNSCC 行為及分子水平改變，進(jìn)而揭示其在HNSCC 中的功能，以期為研究HNSCC 的發(fā)病機(jī)制并遏制其侵襲轉(zhuǎn)移行為提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源

UM-SCC-29 和UM-SCC-47 頭頸部鱗癌細(xì)胞系均由美國密歇根大學(xué)Carey 教授饋贈；HOK16B 永生化角質(zhì)形成細(xì)胞由美國加州大學(xué)洛杉磯分校的Park 博士饋贈。

1.2 主要試劑

CDH11 兔抗人單克隆抗體購自美國CST 公司（編號：A16652），E-鈣粘蛋白單克隆抗體購自美國BD 公司（編號：610182），Twist-1 單克隆抗體購自美國Proteintech 公司（編號：25465-1-AP）， 肌動蛋白（Actin） 單克隆抗體購自美國BD 公司 （編號：612656），RNAiMAX 轉(zhuǎn) 染 試 劑 購 自 美 國Invitrogen公司， 細(xì)胞裂解液購自美國CST 公司，siRNA7 和siRNA78 均購自美國Dharmacon 公司，BCA 試劑盒購自沈陽萬類生物公司。

1.3 Western 印跡法

應(yīng)用細(xì)胞裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，離心取得的上清液即為細(xì)胞總蛋白。 應(yīng)用BCA 法測定樣本蛋白濃度。應(yīng)用Bio-Rad mini 4 分析系統(tǒng)，應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）快速制膠試劑盒（上海雅酶生物科技公司）進(jìn)行凝膠的制備，在蛋白質(zhì)樣品中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴，冰上靜置3 min，上樣量20 μL，并加入5 μL標(biāo)志物，進(jìn)行電泳。 于電轉(zhuǎn)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 應(yīng)用含5%脫脂奶粉的封閉液慢搖1.5 h。TBST 緩沖液洗膜3 次，倒入帶抗體的封閉液，過夜。TBST 緩沖液洗膜3 次，倒入帶有二抗的封閉液。 TBST 緩沖液洗膜3次，應(yīng)用超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，并上機(jī)成像。

1.4 轉(zhuǎn)染

為了下調(diào)HNSCC 細(xì)胞系中CDH11 的表達(dá)，我們用小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）對細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 選取的空白對照組遵循如下序列：siNT：5′-GUGAUUUCAUAGCGAGUUU-3′； 實(shí)驗組選取了2 種siRNA，分別遵循如下序列：siCDH11-7：5′-GGAAAUAGCGCCAAGUUAG-3′，siCDH11-8：5′-CCUUAUGACUCCAUUCAAA-3′。將HNSCC 細(xì)胞接種在6 孔板中， 并使用RNAiMAX 試劑盒轉(zhuǎn)染siRNA。

1.5 細(xì)胞增殖檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24~48 h， 細(xì)胞以等密度接種（UMSCC-29 細(xì)胞：1×104個，UM-SCC-47 細(xì)胞：2×104個）。用Countess 全自動細(xì)胞計數(shù)儀 （美國Invitrogen 公司）在第1、3、5 天對活細(xì)胞、非活細(xì)胞和總細(xì)胞進(jìn)行定量。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24~72 h，將基質(zhì)膠（美國BD 公司）按1∶8 稀釋，包被Transwell 小室底部膜的上室面，置于37 ℃孵箱使基質(zhì)膠聚合；制作細(xì)胞懸液，將200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室，培養(yǎng)細(xì)胞36 h； 取出Transwell 小室， 無鈣磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 遍，將未遷移細(xì)胞用甲醇固定， 用0.1%結(jié)晶紫染色， PBS 清洗3 遍；400 倍顯微鏡下隨機(jī)選取5 個視野觀察細(xì)胞，計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Image J 軟件對Western 印跡法圖像進(jìn)行分析， 采用GraphPad prism 7.0 軟件對基因間的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western 印跡法

我們應(yīng)用Western 印跡法對多組HNSCC 細(xì)胞系及非惡性永生化角質(zhì)形成細(xì)胞 （HOK16B 細(xì)胞）進(jìn)行檢測。 結(jié)果顯示：CDH11 在UM-SCC-29 和UMSCC-47 細(xì)胞中表達(dá)高于在HOK-16B 細(xì)胞中（圖1A）。侵襲是HNSCC 的一個重要特征， 與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞間粘附喪失相關(guān)。 由于CDH11 在多種癌癥中對侵襲、轉(zhuǎn)移有不同的調(diào)節(jié)作用，我們研究了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的表達(dá)與CDH11 的相關(guān)性[4-8]。應(yīng)用Western 印跡法對HNSCC 細(xì)胞系及角質(zhì)形成細(xì)胞中的上皮標(biāo)志物（E-鈣粘蛋白）和間充質(zhì)標(biāo)志物（Twist-1）進(jìn)行檢測，用肌動蛋白（Actin）做對照。結(jié)果顯示，與HOK16B 細(xì)胞相比，UM-SCC-29 和UM-SCC-47 細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的表達(dá)上調(diào)，而Twist-1 的表達(dá)下調(diào)（圖1B）。我們猜測高水平CDH11可能促進(jìn)E-鈣粘蛋白的表達(dá)，抑制Twist-1 的表達(dá)。

圖1 CDH11 及上皮和間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物在HNSCC 細(xì)胞及HOK16B 細(xì)胞中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of CDH11 and epithelial mesenchymal transformation markers in HNSCC cells and HOK16B cells

2.2 轉(zhuǎn)染

我們選擇了siRNA7、siRNA8，通過Western 印跡法證實(shí)其對細(xì)胞內(nèi)CDH11 有下調(diào)作用 （圖2A、2B）。 在降低CDH11 表達(dá)后，檢測上皮和間充質(zhì)標(biāo)志物以確定CDH11 是否對其有負(fù)調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果顯示： 在UM-SCC-29 細(xì)胞中，Twist-1 與CDH11 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與E-鈣粘蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（圖2C）；在UM-SCC-47 細(xì)胞中，E-鈣粘蛋白與CDH11 呈正相關(guān)，與Twist-1 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（圖2D）。重要的是，在HNSCC 細(xì)胞中降低CDH11 表達(dá)后，顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞間粘附降低（圖3）。 因此，CDH11的表達(dá)與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中包括上調(diào)上皮標(biāo)志物（E-鈣粘蛋白）及下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物（Twist-1）。

圖2 CDH11 被沉默后HNSCC 細(xì)胞中上皮和間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)變化情況Figure 2 Changes in the expression of epithelial and mesenchymal transformation marker in HNSCC cells after CDH11 was knocked down

圖3 轉(zhuǎn)染后HNSCC 細(xì)胞形態(tài)的變化（×4）Figure 3 Changes in cell morphology after transfection of HNSCC cells（×4）

2.3 細(xì)胞增殖與侵襲實(shí)驗

siRNA7、siRNA8 誘導(dǎo)的2 種細(xì)胞系（UM-SCC-29、UM-SCC-47）在72 h 時，增殖能力增強(qiáng)；在120 h時，增殖能力顯著增強(qiáng)（圖4）。侵襲是一種促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散的致癌行為。 如圖5A 所示，轉(zhuǎn)染36 h 時，分別經(jīng)siRNA7、siRNA8 沉默CDH11 后，UM-SCC-29 細(xì)胞侵襲能力均增強(qiáng) （siRNA7:P＜0.001，siRNA8:P＜0.05）； 如圖5B 所示，UM-SCC-47 細(xì)胞侵襲能力均增強(qiáng)（siRNA7:P＜0.05，siRNA8:P＜0.01）。 這些發(fā)現(xiàn)與圖2C、2D 中的結(jié)果一致， 證實(shí)了CDH11 作為HNSCC 中抑癌基因的作用。

圖4 HNSCC 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的變化Figure 4 Changes in cell proliferation after transfection of HNSCC cells

圖5 HNSCC 細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h 后細(xì)胞侵襲能力的變化Figure 5 Changes in cell invasion after transfection for 36 h of HNSCC cells

3 討論

鈣粘蛋白是一種跨膜糖蛋白，通過鈣依賴性相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞間的親和力[9]。 鈣粘蛋白含有一個帶負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)域，它可以與Ca2+結(jié)合，而鈣粘蛋白家族成員間的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域有所差異[3]。 鈣粘蛋白超家族成員超過80 個，而CDH11 是鈣粘蛋白超家族經(jīng)典亞類的成員[3,9]。Ⅰ型經(jīng)典鈣粘蛋白包括：E-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白1，N-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白2，P-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白3，R-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白4，CDH11 屬于Ⅱ型經(jīng)典鈣粘蛋白[9]。 其他鈣粘蛋白包括原生鈣粘蛋白、橋粒鈣粘蛋白、七通道跨膜鈣粘蛋白和Ret 酪氨酸激酶[9]。 經(jīng)典的鈣粘蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用、組織穩(wěn)態(tài)和組織形態(tài)的形成。 一個細(xì)胞上的鈣粘蛋白同型二聚體與另一個細(xì)胞上的同型二聚體結(jié)合形成轉(zhuǎn)二聚體，促進(jìn)細(xì)胞間的粘附。 鑒于這些重要作用，鈣粘蛋白的破壞會引起細(xì)胞正常功能的失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)疾病的產(chǎn)生[10]。

CDH11 基因位于16 號染色體上[11]，其與成骨細(xì)胞分化相關(guān)， 促進(jìn)軟骨成骨， 抑制脂肪生成[3,9]。CDH11 可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲和骨轉(zhuǎn)移，在結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)上調(diào)[5,8,12]。 但Mueller 等[13]發(fā)現(xiàn)黑色素瘤組織中CDH11 的表達(dá)缺失。Marchong 等[6]發(fā)現(xiàn)CDH11 在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中發(fā)生基因組缺失，且其缺失與腫瘤侵襲能力增加有關(guān)。 在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中的研究表明，CDH11 具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[6,14]。 此外，CDH11 的表達(dá)升高一定程度上降低了肺癌的轉(zhuǎn)移潛能， 并在骨肉瘤中成為了一種提示預(yù)后較好的預(yù)測因子[15]。 有關(guān)CDH11 與腫瘤關(guān)系的研究目前仍存在爭議， 不同類型癌癥的CDH11 致癌或抑癌功能也不盡相同。本研究中，Western 印跡法的結(jié)果顯示，上皮標(biāo)志物（E-鈣粘蛋白） 表達(dá)水平較高， 而間充質(zhì)標(biāo)志物（Twist-1） 表 達(dá) 水 平 較 低 的HNSCC 細(xì) 胞 系，其CDH11 的表達(dá)水平較正常細(xì)胞有所提高，即與正常角質(zhì)細(xì)胞相比，在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程尚未發(fā)生或在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化水平較低的HNSCC 細(xì)胞中，CDH11 呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平。 在功能研究中，我們發(fā)現(xiàn)降低CDH11 的表達(dá)后，HNSCC 細(xì)胞上皮標(biāo)志物 （E-鈣粘蛋白） 的表達(dá)降低， 而間充質(zhì)標(biāo)志物（Twist-1）的表達(dá)升高，且出現(xiàn)了細(xì)胞間粘附能力降低、增殖能力增強(qiáng)、侵襲能力加強(qiáng)的表現(xiàn)，這充分說明了CDH11 在HNSCC 細(xì)胞中具有抑制腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的作用。 雖然在本研究中，CDH11 的表達(dá)水平升高， 但其對HNSCC 細(xì)胞系的功能影響與Mueller 等[13]、Marchong 等[6]的研究結(jié)果相一致。

綜上所述， 不同種類HNSCC 細(xì)胞系的組織來源各異，如此前提到，對CDH11 的研究應(yīng)考慮腫瘤細(xì)胞的來源。 本實(shí)驗中的CDH11 雖在UM-SCC-29、UM-SCC-47 細(xì)胞中總體呈現(xiàn)高表達(dá)的趨勢，但其在其他來源HNSCC 細(xì)胞系的表達(dá)情況需進(jìn)一步研究。 CDH11 在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的過程中，可能對多種不同的信號通路均有影響。 近期的研究表明，CDH11 通過調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）來調(diào)節(jié)經(jīng)典WNT 信號通路[16]，這為我們發(fā)掘CDH11 調(diào)控腫瘤尤其是HNSCC 的機(jī)制，提供了有力依據(jù)。 為了更好地利用CDH11 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，促進(jìn)腫瘤生物治療的發(fā)展， 有關(guān)CDH11 在HNSCC中發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。