一株降解PHB菌株的分離、鑒定及特性

王振乾，李駿鳴，鄧元告，隋麗英

(天津科技大學亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心，天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457)

塑料制品在方便了人類生活的同時，也給地球帶來了“白色污染”，日益嚴重的污染引發(fā)了社會各界持續(xù)的關(guān)注．

聚-3-羥基丁酸酯(poly-3-hydroxyobutyrate，PHB)是細菌在營養(yǎng)限制條件下積累的胞內(nèi)產(chǎn)物，以顆粒狀態(tài)存在于細胞中，具有貯藏能量和降低細胞內(nèi)滲透壓等作用[1]．PHB除了具有熱塑性、生物相容性、光學活性和壓電性[2]，還具有生物可降解性，是可替代石化合成塑料的原料物質(zhì)[3]．作為 PHB單體的3-羥基丁酸，是抗生素、維生素、芳香素和信息素等化學合成必不可少的手性單體[4]．3-羥基丁酸也是生物體內(nèi)一種常見的物質(zhì)，在動物的新陳代謝中起重要作用[5]，越來越受到人們的關(guān)注．

PHB 的相對分子質(zhì)量為 3.0×107～8.0×107．某些微生物在碳源限制的條件下，利用胞外降解酶將PHB降解為 3-羥基丁酸單體．該有機酸可滲透進入細胞膜，在胞內(nèi)進一步通過脂肪酸 β-氧化過程和三羧酸循環(huán)(TCA)，在有氧條件下產(chǎn)生 CO2和水，在厭氧條件下產(chǎn)生甲烷[6]．從環(huán)境中分離得到的 PHB降解菌大多為細菌和真菌．細菌主要有產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、叢毛單胞菌(Comamonas)、假單胞菌(Pseudomonas)和土壤桿菌(Agrobacterium)；真菌包括曲霉(Aspergillus)、擬青霉菌(Paecilomyces)和青霉(Penicillium)等[5,7]．

PHB生物降解也有其自身的獨特性，作為微生物合成的碳源和能量儲存材料，在細胞內(nèi)很容易被降解；但是，當外界環(huán)境與細胞內(nèi)差異較大，導致 PHB很難被降解．PHB在細胞內(nèi)是以非晶態(tài)存在的[8]，但是商品化的PHB大多是具有很高結(jié)晶度的半晶態(tài)粉末，性質(zhì)的改變同樣導致生物降解難度加大．這就使得研究 PHB高效生物降解與合成同等重要．國際上從20世紀60年代開始陸續(xù)開展了這方面的工作，并已分離出了數(shù)十種可降解 PHB的菌種．在我國，PHB相關(guān)研究起步相對較晚，研究熱點是利用微生物高效合成 PHB，只有東北師范大學陳珊教授團隊做了部分這方面的研究，分離到幾株具有降解 PHB性能的真菌[9-10]．

草酸青霉廣泛存在于土壤和活性污泥等環(huán)境中．草酸青霉細胞分泌多種酶類，可用于生物降解石油烴、果膠、木質(zhì)纖維素和含磷農(nóng)藥等[11-14]，而關(guān)于草酸青霉降解 PHB報道較少[7]．本文從活性污泥中分離得到一株高效降解PHB的草酸青霉菌PHBd-1，并對其 PHB降解特性進行了初步研究，旨在為該菌株在PHB降解中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐．

1 材料與方法

1.1 富集與篩選

活性污泥于 2014年 10月采自天津市東郊污水處理廠．取 1.0g活性污泥，置于 200mL LB富集培養(yǎng)基中培養(yǎng) 72h．取 2mL培養(yǎng)液接種于 200mL PHB-broth中繼續(xù)培養(yǎng) 72h(28℃，150r/min)．將培養(yǎng)液在 LB平板上劃線，挑取單菌落接種于 100mL LB富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h．在PHB平板上挑取產(chǎn)生明顯透明圈的菌落．反復純化 3次，菌株命名為PHBd-1．

LB 富集培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，NaCl 5.0．

PHB-broth(g/L)：人工海鹽 10.0，NH4Cl 0.2和PHB 1.5(純度 98.0%，Goodfellow 公司)[15]．

察氏培養(yǎng)基(g/L)：NaNO33.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01 和蔗糖 30.0．

以上培養(yǎng)基 pH＝7.2．固體培養(yǎng)基在上述配方中添加 1.5%瓊脂．一定鹽度的培養(yǎng)基以濃縮鹵水稀釋為相應(yīng)鹽度配制．

1.2 菌株形態(tài)及分子生物學鑒定

采用點植法在普通察氏培養(yǎng)基與鹽度 3.0%的察氏培養(yǎng)基上接種PHBd-1，在28℃下分別培養(yǎng)6d和9d，觀察菌落形態(tài)．從平板上輕輕地刮下成熟孢子，制成水封片，置于顯微鏡下觀察孢子形態(tài)[16]．

取普通察氏培養(yǎng)基培養(yǎng) 3d的新鮮菌落，加液氮研磨成粉末．提取菌株基因組 DNA(天根生化科技(北京)有限公司)，采用真菌通用引物 ITS1∶5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4∶ 5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′進行 rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列擴增．PCR 反應(yīng)體系(50.0μL)：Mix 25.0μL，ddH2O 17.5μL，引物各 2.5μL，DNA 模板2.5μL．PCR 反應(yīng)條件：95℃預變性 10.0min；95℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 2min，30 個循環(huán)；72℃延伸10min．PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測序．將測得的ITS序列在CBS數(shù)據(jù)庫中進行比對，采用 Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．采用 Mega v5.0 軟件 Clustal W 算法進行看家基因序列比對，使用最大似然估計(maximum likelihood estimation，MLE)算法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，自展重復抽樣次數(shù)為1000 次．

1.3 菌株降解PHB顆粒的特性分析

1.3.1 孢子懸浮液制備

菌株于斜面察氏培養(yǎng)基 28℃下培養(yǎng) 72h，加入無菌生理鹽水，將孢子洗下并轉(zhuǎn)移至 50mL離心管中，重復3次．在離心管中加入小玻璃球，充分振蕩，用滅菌脫脂棉過濾除去菌絲，并用無菌生理鹽水沖洗濾渣 3次，將濾液定容至 500mL，得孢子懸浮液．用血球計數(shù)板在顯微鏡下測定孢子數(shù)目為 2.0×104mL-1．

1.3.2 菌株培養(yǎng)及pH測定

孢子懸浮液以體積比 1∶20比例分別接種到 24個盛有 100.0mL PHB-broth的三角瓶中，28℃、150r/min 振蕩培養(yǎng)．分別在 0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0d各取出 3個三角瓶，于 4℃、12000g離心50min除去菌絲，上清液用定性濾紙抽濾，進一步除去菌絲．用Mettler FE20型pH計測定pH．將濾液置于4℃冰箱保存，用于解聚酶活力的測定．

1.3.3 PHB顆粒降解率測定

PHB降解率采用差減法測定[17]．培養(yǎng)方法及條件同 1.3.2節(jié)．根據(jù)菌絲生長情況，對培養(yǎng)液進行不同處理，以減少 PHB顆粒在菌絲上的附著．當存在少量菌絲時，離心后將沉淀置于 80%丙酮水溶液中浸泡 2h后，于-20℃冷凍；解凍后去除浮在培養(yǎng)液表面的菌絲，重復 3次；用定性濾紙過濾剩余 PHB，蒸餾水洗滌 3次，80℃下干燥 24h后稱量．當幾乎不存在菌絲時，用定性濾紙過濾沉淀，蒸餾水洗滌 3次，80℃下干燥 24h后稱量．當 PHB幾乎全部被降解時，用定性濾紙過濾沉淀，蒸餾水洗滌 3次，80℃下干燥24h后稱量．

1.3.4 3-羥基丁酸含量測定

3-羥基丁酸標準品(百靈威科技有限公司，純度95%)用 5.0mmol/L稀硫酸溶液制作標準曲線，3-羥基丁酸質(zhì)量濃度分別為 0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL．濾液用 2mol/L H2SO4溶液調(diào)至 pH＝2.0．色譜條件參考乳酸的檢測方法：Welch Xtimate Sugar-H色譜柱，5.0mmol/L稀硫酸溶液為流動相，柱溫40℃，流量0.6mL/min，采用示差折光檢測器進行檢測[18]．

1.3.5 解聚酶活力測定

采用福林酚法測定濾液中可溶性蛋白含量[19]，以牛血清蛋白作標準曲線．用比濁法測定 PHB解聚酶活力[10]．酶活力單位定義：每分鐘引起 650nm 波長的吸光度(A650)降低0.1單位所需酶量為1個酶活力單位．PHB懸浮液的制備：精確稱取0.3g PHB粉末，溶解于15.0mL氯仿中，加入0.05g SDS及緩沖液 100mL，超聲振蕩 30min．去除氯仿后，用蒸餾水定容至 100mL，制備 PHB乳濁液，現(xiàn)配現(xiàn)用．不同pH的 PHB乳化液分別用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0，50mmol/L；pH 7.2～7.4，10mmol/L；pH 8.0，50mmol/L)和醋酸鹽緩沖液(pH 4.5，50mmol/L)制備．

測定pH 6.0條件下，溫度分別為30、40、50℃時酶活力．取3.0mL PHB乳化液置于恒溫水浴中預熱10min，加入 3.0mL PHBd-1菌培養(yǎng)液濾液，40min后，于 650nm波長下測定反應(yīng)前后吸光度的變化．在 30℃下，分別測定 pH 為 4.5、6.0、7.2、8.0條件下的酶活力，方法同上．

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)

在普通察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)到第6天，菌落直徑為50～60mm，初期為淡粉色，成熟后菌落中心為深綠色(圖 1)．在鹽度 3.0%察氏培養(yǎng)基上菌落生長相對較慢，為深棕色，培養(yǎng)第 9天菌落直徑為 70～75mm．

圖1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的PHBd-1菌落形態(tài)Fig. 1 Morphology of PHBd-1 colonies in different medium

顯微鏡下觀察，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)菌絲，孢梗莖帚狀枝雙輪生，偶爾三輪生或單輪生，較緊密，分生孢子橢圓形(圖2)．

圖2 菌株P(guān)HBd-1孢子和菌絲形態(tài)Fig. 2 Morphology of spore and mycelium PHBd-1

采用點植法在PHB瓊脂板上培養(yǎng)PHBd-1單菌落．培養(yǎng) 4d，菌落中心呈淺綠色，邊緣呈微粉色，菌落周圍出現(xiàn)明顯透明圈(圖 3)．由于菌落的生長，只在邊緣才能顯示出清晰的透明圈，透明圈可達2.1cm．

圖3 PHBd-1菌株在PHB瓊脂上生長呈現(xiàn)的透明圈Fig. 3 Transparent circle around PHBd-1colony on PHB agar

2.2 菌株ITS序列分析

用真菌通用引物ITS1/ITS4對PHBd-1菌株進行PCR擴增，獲得目的片段長度為 600～800bp．從CBS上進行數(shù)據(jù)進比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖 4)，實驗菌株和草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)聚類在一起，結(jié)合形態(tài)特征分析，將該菌株命名 Penicillium oxalicum strain PHBd-1．

圖4 基于菌株P(guān)HBd-1的ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on ITS sequence of PHBd-1

2.3 PHB顆粒降解率、培養(yǎng)液pH和3-羥基丁酸含量

在 10d的培養(yǎng)過程中，PHB顆粒降解率迅速增加，4d后接近100%(圖5)．與此同時，培養(yǎng)液pH則顯著下降，從初始的 pH 7.2逐漸降至第 4天的 pH 3.1，并穩(wěn)定于pH 2.8左右．

圖5 PHB顆粒降解率和培養(yǎng)液pH變化Fig. 5 Degrading rate of PHB particles and pH variations of the medium

培養(yǎng)前 2d時，培養(yǎng)液中的 3-羥基丁酸含量較低(＜0.2mg/mL)，4～6d時達到最高(1.2mg/mL)，8～10d時 3-羥基丁酸含量下降并趨于穩(wěn)定(0.7mg/mL)(圖 6)．

圖6 培養(yǎng)液中3-羥基丁酸含量Fig. 6 Content of 3-hydroxybutyrate in the medium

2.4 pH和溫度對PHB解聚酶活力的影響

培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中胞外可溶性蛋白含量逐漸增加，第8天出現(xiàn)峰值(363.0 μg/mL)，之后有所降低(圖 7)．

圖7 培養(yǎng)液中胞外可溶性蛋白含量Fig. 7 Extracellular soluble protein content in the medium

培養(yǎng)過程中，在 30、40、50℃下培養(yǎng) 1.5d時酶活力達到最高峰(圖 8)．溫度較低時酶活力較高，SPSS 軟件統(tǒng)計分析，1.5、2d 時，在 30、40、50℃下酶活力有顯著差異(P＜0.05)，2d后無顯著差異(P＞0.05)．

圖8 溫度對PHB解聚酶活力的影響Fig. 8 Effect of temperature on the degrading enzymatic activity of PHB

在 30℃時，不同 pH下酶活力均在初期有較大提高，pH 4.5時酶活力顯著高于pH 6.0、pH 7.2和pH 8.0(圖9)．pH 4.5條件下，酶活力于培養(yǎng)4d時達到峰值，其余 pH條件下均在培養(yǎng) 1.5d(36h)時達到峰值，之后逐漸下降并趨于平穩(wěn)．

圖9 pH對PHB解聚酶活力的影響Fig. 9 Effect of pH on the degrading enzymatic activityof PHB

3 討 論

王戰(zhàn)勇等[20]通過紫外誘變的方法誘變出一株高效降解 PHB的青霉菌(Penicillium sp.)，日均降解率由野生株的12.5%提高到20.0%．張敏等[21]將不同比例的聚丁二酸丁二醇酯/聚羥基丁酸酯(PBS/PHB)共混物分別放入土壤培養(yǎng)液和熟化過的堆肥培養(yǎng)液中，通過微生物茲化反應(yīng)研究降解性；結(jié)果表明，共混物在堆肥培養(yǎng)液中降解 60d后的質(zhì)量損失率達到62%．陳珊等[9]在活性污泥中分離出的可降解 PHB的菌株，并對其最適降級條件進行優(yōu)化，PHB最大失重率達到 60%．而本研究中，從污水處理廠活性污泥中分離得到一株草酸青霉 PHBd-1．在 4d培養(yǎng)時間內(nèi)，PHBd-1對 PHB顆粒降解率達到 90.0%，是一株高效降解PHB的菌株．

微生物通過分泌到細胞外的 PHB解聚酶降解PHB，不同微生物所產(chǎn)生的解聚酶類型和作用機理不盡相同．PHB顆粒在解聚酶作用下降解，形成單體和二聚體混合物，二聚體隨之在二聚體水解酶作用下形成單體，進入細胞參與代謝[22]．本研究中 PHB降解率的提升伴隨著培養(yǎng)液 pH的顯著下降，推測是由于PHB被菌株所產(chǎn)生的解聚酶降解成可溶性小分子有機酸，主要是3-羥基丁酸及其二聚體或三聚體等．培養(yǎng)前 2d的 PHB降解較快，但此時 3-羥基丁酸含量較低，推測此時菌株大量利用 3-羥基丁酸進行生長．2d后菌株開始大量合成與積累 PHB解聚酶，PHB降解速率加快，3-羥基丁酸含量升高．這也能解釋第 2天酶活力突然下降后回升的現(xiàn)象．后期培養(yǎng)液中 3-羥基丁酸的含量出現(xiàn)下降，可能是因為聚-3-羥基丁酸酯基本被降解完，沒有新的單體產(chǎn)生，而培養(yǎng)液中 3-羥基丁酸單體的參與到菌體細胞代謝被消耗導致．培養(yǎng)液 pH前期下降主要是大量的 3-羥基丁酸單體產(chǎn)生導致，培養(yǎng)后期由于 pH迅速下降，菌種利用 3-羥基丁酸作為碳源參與代謝，不再產(chǎn)生解聚酶或產(chǎn)生的酶減少，導致剩余聚-3-羥基丁酸酯不能再被降解[23]．

不同微生物所產(chǎn)生的PHB解聚酶的最適pH不同．大多數(shù)解聚酶的最適 pH為堿性范圍(pH 7.5～9.8)，但皮氏假單胞菌(Pseudomonas pickettii)和繩狀青霉(Penicillium funiculosum)胞外解聚酶的最適 pH分別為5.5和6.0[24]．本研究中培養(yǎng)基中粗酶液在pH 4.5時酶活力最高，為酸性酶．pH 4.5條件下，酶活力在培養(yǎng)4d時達到峰值，其余pH條件下在培養(yǎng)1.5d時達到峰值，之后逐漸下降并趨于平穩(wěn)．推測該酶的合成類型為滯后合成型，待菌株利用部分降解產(chǎn)物生長后再大量分解 PHB胞外解聚酶．溫度對酶活力的影響并不顯著，因此推測溫度可能是通過控制菌株的生長速率來提高PHB的降解率．

致謝：感謝天津科技大學食品科學與工程學院王玉榮老師對本研究提出的建議、化工與材料學院張愛群老師提供的活性污泥樣品．