風(fēng)濕性疾病代謝組學(xué)研究

白晶晶，吳嬋媛，鐘丹麗，王遷，曾小峰

系統(tǒng)生物學(xué)從生命整體層面研究生物分子間的相互作用對(duì)生物體功能的影響，其興起得益于組學(xué)分析方法以及生物信息學(xué)的發(fā)展。有別于僅能提供有限的目的分子以及通路信息的傳統(tǒng)分子生物學(xué)和生理學(xué)技術(shù)，組學(xué)技術(shù)可以對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行全面而整體的描述。1998年Oliver等[1]通過(guò)檢測(cè)酵母部分基因缺失而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及代謝組三個(gè)層面的相對(duì)變化，對(duì)釀酒酵母的基因組進(jìn)行了系統(tǒng)的功能分析,首次提出代謝組的概念，即一個(gè)有機(jī)體所表達(dá)的全部代謝分子的集合。2001年Fiehn[2]將代謝組學(xué)定義為對(duì)所研究的生物系統(tǒng)包含的代謝分子進(jìn)行全面而定量的分析。脂質(zhì)組學(xué)是代謝組學(xué)的一個(gè)分支，研究在不同狀態(tài)下患者的脂質(zhì)代謝以及由脂質(zhì)介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有調(diào)節(jié)功能的信號(hào)過(guò)程。代謝組學(xué)的分析類(lèi)型包括非靶向與靶向代謝組學(xué)分析，核磁共振與質(zhì)譜技術(shù)是代謝組學(xué)的主要技術(shù)平臺(tái)。

2005年加拿大基因組委會(huì)投資開(kāi)展“人類(lèi)代謝組計(jì)劃”，旨在通過(guò)促進(jìn)代謝組學(xué)的研究改善疾病的診斷、預(yù)后以及監(jiān)測(cè)；提升對(duì)藥物代謝與毒理的深入認(rèn)識(shí)；實(shí)現(xiàn)基因組與代謝組的整合以及加快代謝組學(xué)相關(guān)軟件的開(kāi)發(fā)。目前，人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(human metabolome database, HMDB)包含114 100種代謝分子、25 770個(gè)代謝通路、5 498種與疾病相關(guān)的化合物以及3 056種與單個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)相關(guān)的代謝物等[3]?，F(xiàn)階段與人類(lèi)疾病相關(guān)的代謝組學(xué)研究主要集中在腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、肝臟以及腎臟疾病[4]。本文主要從代謝組學(xué)的工作流程、代謝組學(xué)在風(fēng)濕性疾病中的應(yīng)用以及對(duì)未來(lái)的展望三個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 代謝組學(xué)的工作流程

代謝組學(xué)的工作流程包括生物學(xué)問(wèn)題的提出、樣本收集與預(yù)處理、數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)分析。提出明確清晰的生物學(xué)問(wèn)題是代謝組學(xué)研究的首要步驟，其決定了研究采用的技術(shù)平臺(tái)、分析方法(靶向與非靶向代謝組學(xué)研究)、樣本類(lèi)型(生物液體、組織、細(xì)胞等)、樣本數(shù)量以及實(shí)驗(yàn)條件等的選取。代謝組學(xué)研究需要完整并嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括合適的樣本數(shù)量、規(guī)范一致的樣本收集與儲(chǔ)存過(guò)程以及匹配的對(duì)照樣本等。

樣本收集后需要進(jìn)行預(yù)處理。目前代謝組學(xué)研究尚沒(méi)有一種普遍適用的標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理方案，不同的方案會(huì)產(chǎn)生不同的分析結(jié)果，預(yù)處理方案的優(yōu)化則可有效提高鑒定的代謝分子數(shù)量，基本原則是盡可能客觀地保留并反映樣本中的代謝信息[5]。

樣本收集與預(yù)處理完成后，需要選取合適的分析技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，由于樣本化學(xué)組分的理化性質(zhì)差異較大，至今尚無(wú)單一技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本進(jìn)行充分的分離和鑒定，目前多采用聯(lián)用技術(shù)，比如色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)兼有色譜的高分離度與質(zhì)譜的高靈敏度的特性，廣泛應(yīng)用于臨床代謝組學(xué)的研究。對(duì)于采集到的元數(shù)據(jù)進(jìn)行濾噪、峰對(duì)齊、峰匹配、標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化等預(yù)處理后，常用非監(jiān)督與監(jiān)督方法對(duì)樣本進(jìn)行分析。偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)是目前廣泛采用的監(jiān)督分析方法。對(duì)非靶向代謝組學(xué)研究得到的差異代謝分子的鑒定與功能注釋需要依靠數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，常用的開(kāi)源數(shù)據(jù)庫(kù)包括HMDM[3]、KEGG[6]、PubChem[7]、Metlin[8]以及MassBank[9]等。

2 代謝組學(xué)在風(fēng)濕性疾病中的應(yīng)用

2.1 生物標(biāo)記物篩選

2.1.1 系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systematic lupus erythemato-sus, SLE)是一種伴有多器官損害的自身免疫性疾病，多種致病機(jī)制參與，引起免疫耐受受損與器官功能異常[10]。Yan等[11]人對(duì)比80例SLE患者與57例性別年齡匹配的健康對(duì)照的血清代謝譜，發(fā)現(xiàn)SLE患者血清中多種氨基酸、碳水化合物、脂肪酸、延胡索酸、氨基丙二酸、蘇糖酸以及α-生育酚等代謝分子水平下降；甲硫氨酸、谷氨酸、胱氨酸、1-單棕櫚酸甘油酯以及2-羥基異丁酸甲酯等水平上升。差異代謝分子主要富集的代謝通路包括蛋白質(zhì)的合成、氨循環(huán)、天冬氨酸代謝與半乳糖代謝等。活動(dòng)期的SLE患者血清谷氨酸與2-羥基異丁酸水平升高而檸檬酸鹽、亞油酸以及對(duì)羥基苯甲酸丙酯水平下降。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)SLE患者的糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂肪酸β氧化以及氨基酸代謝異常，間接導(dǎo)致能量的生物合成下降，并發(fā)現(xiàn)SLE患者血清中的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物13-羥基-十八碳二烯酸與9-羥基-十八碳二烯酸水平升高，抗氧化劑谷胱甘肽水平下降，代謝組表現(xiàn)出顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化，反映SLE患者存在氧化應(yīng)激損傷。

2.1.2 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)炎，晚期因軟骨與骨侵蝕造成關(guān)節(jié)破壞。早期診斷與早期規(guī)范化治療對(duì)于降低RA患者多種并發(fā)癥，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間至關(guān)重要。Yousri等[13]對(duì)132例RA患者的血漿代謝組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)32種與RA相關(guān)的代謝分子，包括已經(jīng)報(bào)道的脫氫表雄酮硫酸鹽、皮質(zhì)醇、雄烯二酮等，并擴(kuò)展到類(lèi)固醇代謝途徑中其他代謝分子。利用代謝譜進(jìn)行RA分類(lèi)的敏感度為91%特異度為88%。Dubey等[14]利用核磁共振技術(shù)，分析RA患者與自身反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(Reactive arthritis, ReA)患者血清代謝分子差異，構(gòu)建了用于鑒別ReA與RA的代謝分子模型。生物制劑的應(yīng)用對(duì)RA患者的管理產(chǎn)生了革命性的改變，然而約30%～40%的患者對(duì)生物制劑的反應(yīng)不佳[15]。Takahashi等[16]前瞻性地招募了43例病情活動(dòng)的RA患者并利用毛細(xì)管電泳飛行質(zhì)譜分析患者的血清代謝譜，隨后26例患者給予腫瘤壞死因子抑制劑(Tumor Necrosis Factor inhibitor, TNF i)，17例患者給予阿巴西普(Abatacept, ABT)治療，12周后評(píng)估發(fā)現(xiàn)14例TNFi組與11例ABT組患者DAS28-CRP顯著下降，對(duì)比反應(yīng)不佳患者的代謝譜，TNFi組與ABT組分別鑒定出五種與三種差異的關(guān)鍵代謝物，可用于預(yù)測(cè)RA患者對(duì)于治療的反應(yīng)。

2.1.3 骨關(guān)節(jié)炎

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是關(guān)節(jié)炎中最為常見(jiàn)的類(lèi)型，約10%的60歲及以上的世界人口患有癥狀性O(shè)A[17]。Zheng等[18]在OA患者的關(guān)節(jié)滑液中發(fā)現(xiàn)6種差異代謝分子，并經(jīng)靶向代謝組學(xué)證實(shí)前三種代謝物，包括谷氨酰胺、1,5-脫水葡萄糖醇以及葡萄糖內(nèi)酯，組合可顯著區(qū)分OA患者與健康人群，單一分子葡萄糖內(nèi)酯則可有效區(qū)分OA與RA患者。Jonasdottir等[19]在OA與RA患者的關(guān)節(jié)滑液中檢測(cè)到37種脂質(zhì)分子，包括多不飽和脂肪酸以及與促炎相關(guān)的脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)與環(huán)氧合酶(cyclooxygenase, COX)通路的代謝分子，如前列腺素E2以及血栓烷B2等，代謝分子與其前體分子的比率表明OA患者的5-LOX與15-LOX活性相比RA患者低，而COX來(lái)源的代謝分子則沒(méi)有差別，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)滑膜組織細(xì)胞與關(guān)節(jié)滑液中的炎性細(xì)胞可能是5-LOX與15-LOX代謝產(chǎn)物的來(lái)源。

2.1.4 其他風(fēng)濕性疾病

白塞病(Beh?et’s disease, BD)是一種多系統(tǒng)累及的血管炎性疾病，因缺乏特異性的血清學(xué)標(biāo)志物，早期診斷與早期治療相對(duì)困難。Zheng等[20]研究發(fā)現(xiàn)BD患者血清磷脂酰膽堿水平降低，多種不飽和脂肪酸水平升高，其中，血清亞油酸與花生四烯酸在BD患者治療緩解后顯著降低，并經(jīng)驗(yàn)證隊(duì)列證實(shí)，BD患者血清亞油酸與花生四烯酸較疾病對(duì)照患者顯著升高，受試者工作特征顯示較高的靈敏度與特異度，有望成為BD患者的診斷標(biāo)志物。

大動(dòng)脈炎(takayasu arteritis, TA)是一種隱匿的慢性疾病，通常在臨床上首先表現(xiàn)為不可逆的血管狹窄。Jain等[21]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸與N-乙酰糖蛋白對(duì)病情活動(dòng)組與穩(wěn)定組的TA患者有較好的區(qū)分度，長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)組TA患者在病情治療穩(wěn)定后代謝特征發(fā)生改變，穩(wěn)定組TA患者經(jīng)免疫抑制劑治療與未經(jīng)免疫抑制劑治療的血清代謝譜差異不明顯，但仍需較大的縱向TA患者隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證。

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren’s syndrome, pSS)是一種以唾液腺與淚腺功能低下為主要特征的自身免疫性疾病。Kageyama等[22]檢測(cè)pSS患者與健康人群唾液中的代謝分子，發(fā)現(xiàn)pSS患者唾液代謝物多樣性降低，部分代謝物分子的種類(lèi)下降可能與慢性唾液腺炎導(dǎo)致的唾液腺破壞有關(guān)。

多發(fā)性肌炎(polymyositis, PM)與皮肌炎(dermatomyositis, DM)是以骨骼肌無(wú)力為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病。Raouf等[23]發(fā)現(xiàn)PM/DM患者的血清脂質(zhì)譜的脂肪酸結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，棕櫚酸水平顯著高于健康對(duì)照，而花生四烯酸的水平則顯著降低?？傮w來(lái)講，飽和脂肪酸水平升高而二十二碳六烯酸水平下降，不飽和脂肪酸水平?jīng)]有顯著差異?；颊哐寮∷峒っ概c幾種脂質(zhì)分子的水平之間的相關(guān)性表明脂質(zhì)變化可能與肌肉的運(yùn)動(dòng)功能異常有關(guān)。

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是一種主要累及中軸骨的慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎。Wang等[24]分析AS患者尿液、血漿以及韌帶組織的代謝譜并篩選出20種相關(guān)的代謝分子組合，可作為AS患者的潛在生物標(biāo)記物，通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn)代謝物與脂肪代謝、腸道微生物代謝、糖代謝以及膽堿代謝通路相關(guān)，并可能參與免疫調(diào)節(jié)。

2.1.5 風(fēng)濕性疾病相關(guān)內(nèi)臟并發(fā)癥

風(fēng)濕性疾病常并發(fā)多器官累及，影響患者的遠(yuǎn)期預(yù)后[25]。Guleria等[26]研究發(fā)現(xiàn)相比未合并腎炎的SLE患者，狼瘡腎炎患者血清的脂類(lèi)代謝分子包括低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸與甘油三酯水平升高而醋酸鹽的水平下降。經(jīng)過(guò)6個(gè)月的治療，升高的脂類(lèi)分子水平顯著下降，醋酸鹽的水平上升，并與SLEDAI和血清中補(bǔ)體水平具有顯著的相關(guān)性，狼瘡腎炎患者經(jīng)過(guò)免疫抑制劑治療后血清代謝組發(fā)生重塑，可用于監(jiān)測(cè)患者對(duì)于治療方案的反應(yīng)[27]。

RA患者可出現(xiàn)急性起病的彌漫性間質(zhì)性肺疾病(acute-onset diffuse interstitial lung disease, AoDILD)，F(xiàn)urukawa等[28]分析10例伴發(fā)AoDILD的RA患者發(fā)病與穩(wěn)定期的血清代謝組，發(fā)現(xiàn)甘露糖胺、蒜氨酸、犬尿氨酸、2-羥基丁酸四種代謝物構(gòu)成的PLS-DA模型可有效評(píng)估RA患者的AoDILD病情。

2.2 發(fā)病機(jī)制研究

聯(lián)合其他組學(xué)技術(shù)并進(jìn)行生物信息學(xué)挖掘是代謝組學(xué)突破生物標(biāo)記物層面向疾病機(jī)制進(jìn)行探索的必經(jīng)之路。Rodgers等[29]將健康對(duì)照的外周血單核細(xì)胞置于含有RA患者關(guān)節(jié)滑液的缺氧培養(yǎng)體系中，利用質(zhì)譜技術(shù)分析單核細(xì)胞的代謝譜發(fā)現(xiàn)相比單純暴露于缺氧體系與LPS刺激的缺氧體系，置于RA患者關(guān)節(jié)滑液中的單核細(xì)胞中左旋肉堿、?；鈮A、3-脫羥基肉堿以及O-乙酰肉堿水平升高。研究者結(jié)合RA患者外周血單核細(xì)胞與關(guān)節(jié)滑液巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RA患者的外周血單核細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜后，脂肪酸代謝發(fā)生改變并促進(jìn)CCL20介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

目前已有文獻(xiàn)廣泛報(bào)道系統(tǒng)性自身免疫性疾病患者腸道菌群失衡[30]，Bellocchi等[31]聯(lián)合血漿代謝組學(xué)與腸道微生態(tài)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性自身免疫性疾病的患者的腸道菌群與代謝功能存在聯(lián)系，通過(guò)飲食或者其他干預(yù)方式調(diào)整菌群可能成為解決由菌群失衡導(dǎo)致的系統(tǒng)性損害的潛在策略，同時(shí)患者血漿代謝分子變化也成為反映腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的指標(biāo)。

風(fēng)濕性疾病患者代謝異常不僅體現(xiàn)在體液代謝分子的水平異常以及腸道菌群的比例失衡等系統(tǒng)性的代謝紊亂，同時(shí)也包括免疫細(xì)胞內(nèi)的代謝通路的異?；罨热缯{(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與能量利用的mTOR通路以及與炎癥相關(guān)的5-LOX通路[32-33]。2011年Mathis等[34]首次提出免疫代謝的概念，即研究免疫反應(yīng)與代謝過(guò)程間的相互作用。相關(guān)研究主要包括兩個(gè)方面，即從生物體器官組織水平研究免疫與代謝的作用關(guān)系以及從細(xì)胞水平檢測(cè)免疫細(xì)胞的代謝狀態(tài)，為疾病發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路，并逐漸成為免疫學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。風(fēng)濕性疾病代謝組學(xué)研究主要特點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 風(fēng)濕性疾病代謝組學(xué)研究主要特點(diǎn)

3 展望

風(fēng)濕性疾病的一個(gè)主要特征是患者血清自身抗體的產(chǎn)生，特異性抗體以及標(biāo)記性抗體對(duì)于疾病診斷具有重要的指導(dǎo)意義，但是也存在陽(yáng)性率不高、多數(shù)風(fēng)濕性疾病目前缺乏特異性的自身抗體以及自身抗體滴度與病情相關(guān)性較低等問(wèn)題，并且具有同種自身抗體的患者的臨床表現(xiàn)仍多種多樣，對(duì)于疾病表型進(jìn)行精準(zhǔn)的分子分型有賴(lài)于更多的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。

代謝組學(xué)為描述風(fēng)濕性疾病的代謝特征以及相關(guān)的生物標(biāo)記物的篩選提供了技術(shù)支持，但是由于代謝分子的物理化學(xué)性質(zhì)復(fù)雜，目前沒(méi)有一個(gè)通用的分析平臺(tái)和一致性的操作方案，所以不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果存在差異。目前大部分尋找生物標(biāo)記物的研究?jī)H停留在標(biāo)記物的初篩階段，沒(méi)有進(jìn)行分析驗(yàn)證以及臨床驗(yàn)證。利用小樣本進(jìn)行標(biāo)志物試驗(yàn)性地鑒定相對(duì)容易，但是因?yàn)槎喾N混雜因素的存在，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性較低。目前風(fēng)濕性疾病有文獻(xiàn)報(bào)道的樣本量大于100例的代謝組學(xué)研究主要集中在患病率較高的疾病如RA以及SLE等，但是存在分組不明確，患者資料采集不完整而導(dǎo)致混雜因素過(guò)多的問(wèn)題，如疾病活動(dòng)程度、糖皮質(zhì)激素的使用劑量、患者的BMI以及采集標(biāo)本時(shí)患者是否空腹等，對(duì)于代謝組學(xué)的結(jié)果解釋帶來(lái)困難。高質(zhì)量的風(fēng)濕性疾病研究隊(duì)列、規(guī)范化的生物樣本收集與儲(chǔ)存流程、完備的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及嚴(yán)格的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是進(jìn)行代謝組學(xué)生物標(biāo)記物研究的必要條件。目前，風(fēng)濕性疾病相關(guān)的代謝組學(xué)研究數(shù)量不斷增長(zhǎng)，產(chǎn)生了大量代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，建立風(fēng)濕性疾病相關(guān)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)有助于改善風(fēng)濕性疾病的診斷、預(yù)后以及監(jiān)測(cè)，促進(jìn)對(duì)臨床試驗(yàn)藥物的代謝與毒理的深入認(rèn)識(shí)并實(shí)現(xiàn)多組學(xué)信息的整合。

在發(fā)病機(jī)制研究方面，科學(xué)界正在積極探索代謝組學(xué)的功能特征[35-36]。免疫代謝的興起為風(fēng)濕性疾病的機(jī)制研究提供了新的方向，單細(xì)胞代謝組學(xué)以及基于質(zhì)譜成像技術(shù)的空間代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展將推動(dòng)功能代謝組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，促進(jìn)人類(lèi)從生物代謝的角度對(duì)生命與疾病進(jìn)行深入的理解。