運(yùn)動(dòng)通過(guò)調(diào)節(jié)皮層-紋狀體通路功能連接可塑性改善PD模型大鼠行為

時(shí)凱旋，劉曉莉，喬德才

（1.北京師范大學(xué) 體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875；2.中國(guó)地質(zhì)大學(xué) 體育部，北京 100083）

帕金森病（Parikinson’s disease，PD）是一種典型的神經(jīng)退行性疾病，運(yùn)動(dòng)不能、肌僵直、姿勢(shì)/步態(tài)異常及震顫麻痹是主要臨床癥狀（Lang et al.，1988）。PD發(fā)病機(jī)制尚不明確，多巴胺（dopamine，DA）缺失后皮層-紋狀體谷氨酸（glutamate，Glu）能過(guò)度傳導(dǎo)，引起皮層-基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路內(nèi)參與運(yùn)動(dòng)調(diào)控的多個(gè)核團(tuán)β振蕩增高及同步性增強(qiáng)，從而影響運(yùn)動(dòng)調(diào)控神經(jīng)信息的正常編碼，被認(rèn)為是PD運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)（Bell et al.，2015；Sanabria et al.，2017）。臨床研究證實(shí)，丘腦底核深部腦刺激術(shù)和左旋多巴藥物治療均可降低皮層-基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路β振蕩的同步性，為同步振蕩與行為功能的關(guān)聯(lián)性提供了直接證據(jù)（Accolla et al.，2016；Gulberti et al.，2015）。

目前，臨床仍缺乏有效治愈PD的方法，藥物或手術(shù)療法僅能延緩或減輕PD病癥（Raza et al.，2019）。近年發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)療法可顯著改善PD患者運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)和自主生活能力，提高藥物和手術(shù)治療的有效性，因而逐漸被臨床認(rèn)可與運(yùn)用（Ridgel et al.，2009）。圍繞皮層-紋狀體通路在PD運(yùn)動(dòng)防治中的重要作用的研究，已經(jīng)證實(shí)運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)保護(hù)作用可降低PD大鼠紋狀體胞外Glu濃度（Shi et al.，2019），抑制PD小鼠皮層-紋狀體Glu突觸傳遞效能的異常增高（趙剛等，2019）；減輕了PD大鼠皮層-紋狀體Glu興奮性毒作用導(dǎo)致的紋狀體中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）結(jié)構(gòu)與功能的異常（Wei et al.，2017），為PD皮層-紋狀體通路功能的運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性發(fā)生奠定了良好的基礎(chǔ)。第Ⅱ組代謝型谷氨酸受體（ionot ropic glutamate receptors，mGluR2/3）主要分布于皮層-紋狀體Glu突觸前膜，是調(diào)節(jié)突觸前Glu釋放及突觸傳遞效能的重要細(xì)胞分子（Conn et al.，2005），推測(cè)PD大鼠皮層-紋狀體通路功能連接可塑性可能與運(yùn)動(dòng)干預(yù)上調(diào)mGluR2/3表達(dá)、抑制皮層-紋狀體Glu釋放有關(guān)，但目前尚未見(jiàn)到相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。為此，擬采用在體多通道電生理記錄技術(shù)，觀察運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路β振蕩同步性變化，并采用生化技術(shù)檢測(cè)紋狀體胞外Glu濃度及mGluR2/3表達(dá)，從Glu介導(dǎo)的皮層-紋狀體通路功能連接可塑性的角度進(jìn)一步闡釋運(yùn)動(dòng)改善PD模型大鼠行為功能的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與流程

大鼠在第2周開(kāi)始進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，剔除不能進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的大鼠，在第2周末進(jìn)行6-羥基多巴（6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA）注射及電極或探針植入手術(shù)。在術(shù)后第1周周末進(jìn)行阿樸嗎啡（apomorphine，APO）誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試，剔除不成模大鼠。在第0周末進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試與電信號(hào)記錄，第1周運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)；行為學(xué)測(cè)試和電信號(hào)的記錄于第1、2、3、4周的固定時(shí)間完成，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后48 h進(jìn)行生化檢測(cè)（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程Figure 1.Protocol of the Experimental Trials

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用雄性Sprague-Dawley 8周齡大鼠（體重230～250 g）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。大鼠實(shí)行分籠飼養(yǎng)，自由飲食，動(dòng)物房室內(nèi)溫度控制在20℃～25℃，相對(duì)濕度為45%～50%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)安靜組（Control）和PD模型組，待模型鑒定成功后再分為PD安靜組（PD）和PD運(yùn)動(dòng)組（PD+Ex）。每組根據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)不同又分為2個(gè)亞組，即電生理實(shí)驗(yàn)組（Control：n=8；PD：n=7；PD+Ex：n=9）、微透析-高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）與蛋白檢測(cè)組（Control：n=10；PD：n=11；PD+Ex：n=14）。

1.3 PD模型制備與電極、探針植入手術(shù)

單側(cè)損傷PD大鼠模型制備。采用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠。參考Paxinos等（1997）大鼠腦立體定位圖譜，標(biāo)記右側(cè)內(nèi)前腦側(cè)束（medial forebrain bundle，MFB；AP：-4.3 mm，R：1.5 mm，DV：7.6～7.8 mm）為染毒注射位點(diǎn)。采用微量注射泵將6-OHDA以1 μL/min速度注射4 μL，留針5 min后再緩慢退針。假手術(shù)組大鼠在相同注射位點(diǎn)給予等量賦形劑含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。

電極植入手術(shù)。16通道梯度陣列電極（Stablohm 675，間距 200 μm，直徑 35 μm）包括 8短和 8長(zhǎng)記錄電極及1根參比電極。6-OHDA或賦形劑注射完成后，選取運(yùn)動(dòng)皮層（AP：1.8～3.0 mm，R：2.3～3.3 mm）、紋狀體（AP：0～1.4 mm，R：2.3～3.3 mm）為開(kāi)顱區(qū)；于手術(shù)顯微鏡（WPI，USA）下剝離硬腦膜，電極固定于微推進(jìn)器（Kofe，USA）后緩慢將8通道短電極植入運(yùn)動(dòng)皮層（DV：2.0～2.5 mm），其他8通道長(zhǎng)電極植入紋狀體（DV：4.0～5.5 mm）；記錄頁(yè)面觀察到至少3/16通道神經(jīng)元放電幅值的信噪比＞3：1時(shí)停止。信號(hào)穩(wěn)定后采用生物硅膠（WPI，USA）封口充當(dāng)顱骨，牙科水泥固定電極并覆蓋顱骨表面。術(shù)后碘伏消毒并腹腔注射青霉素減少感染。

探針植入手術(shù)。開(kāi)顱手術(shù)與上述方法相同，6-OHDA藥物注射后采用右側(cè)紋狀體（AP：0.3 mm，R：3.5 mm，DV：3.5 mm）為探針埋藏位點(diǎn)，緩慢將微透析探針和套管尖端下至該位置，螺絲固定后采用牙科水泥覆蓋，術(shù)后護(hù)理與上述方法一致。

1.4 PD大鼠模型評(píng)價(jià)

1.4.1 APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為試驗(yàn)

大鼠6-OHDA染毒術(shù)后第7天于頸部皮下注射APO（0.5 mg/kg），穩(wěn)定5 min后開(kāi)始記錄旋轉(zhuǎn)行為，記錄時(shí)間為30 min；以向右側(cè)（損傷側(cè)）旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與向左側(cè)（健側(cè)）旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的差值＞100轉(zhuǎn)/30 min作為PD大鼠模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)（Jia et al.，2019）。

1.4.2 酪氨酸羥化酶的免疫組化檢測(cè)

免疫組化。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后48 h，采用10%水合氯醛（4.5 ml/kg）麻醉大鼠、灌流取腦，在多聚甲醛（4%）中浸泡固定24 h，用蔗糖（30%）脫水、包埋后進(jìn)行切片（片厚30 μm）。經(jīng)免疫組化ABC法染色后，每只大鼠選用黑質(zhì)（AP：-4.2～-6.6 mm）和紋狀體（AP：2～-1 mm）連續(xù)相鄰切片，均取片6張，使用相同的配置及光強(qiáng)度對(duì)每一張切片進(jìn)行拍照。用Image-pro Plus 6.0軟件對(duì)黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和紋狀體TH陽(yáng)性纖維陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)定量，選取右側(cè)腦相同區(qū)域位置0.04 mm2矩形框，每只大鼠選取3個(gè)相同層面的切片。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化操作方法：相同的矩形框，選取皮質(zhì)白質(zhì)部位的光密度值為W，紋狀體或黑質(zhì)部位的光密度值為S，得到標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)C=（S-W）/（S+W），損傷側(cè)與未損側(cè)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算后，將損傷側(cè)/未損傷側(cè)比值作為最后評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.5 mGluR2/3蛋白的免疫印跡檢測(cè)

免疫印跡（western bolt，WB）。大鼠麻醉后取腦，于冰上迅速剝離右側(cè)紋狀體，加入適量裂解液提取各組腦組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后加入5倍SDS緩沖液，沸水煮5 min，冷卻后于-80℃冰箱保存待測(cè)。取30 μg蛋白樣本，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。將PVDF膜置入保鮮膜中，加入封閉液，室溫條件下緩慢搖動(dòng)90 min。將膜置于用TBST溶解的5%脫脂奶粉中封閉，加入一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗膜，加入二抗放置在搖床上，室溫下孵育90 min后洗膜。室溫反應(yīng)1 h加入ECL化學(xué)發(fā)光液于膜上，X射線曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參照，采用圖像分析軟件分析圖片，以每個(gè)條帶的積分光密度（integral optical density，IOD）值與其相對(duì)應(yīng)的β-actin IOD值之比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

PD+Ex組大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)在第1周介入，采用Tajiri等（2010）提出的勻速跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案（11 m/min，30 min/天，5天/周，共4周）。運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)間在每天同一時(shí)間進(jìn)行，環(huán)境保持一致。

1.7 自主活動(dòng)行為測(cè)試

采用自主活動(dòng)監(jiān)測(cè)裝置（Panlab，Spanish）記錄大鼠自主活動(dòng)行為（圖2）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先將大鼠置于清潔測(cè)試箱中適應(yīng)5 min，正式測(cè)試時(shí)間為30 min。每次測(cè)試完畢取出大鼠，用75%酒精和紙巾清潔箱體內(nèi)部，確保不影響下次測(cè)試。采用SMART 3.0軟件對(duì)總運(yùn)動(dòng)距離（distance in zone）、快速移動(dòng)（fast moving）、慢速移動(dòng)（slow moving）、安靜狀態(tài)（resting）時(shí)間占比等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

1.8 紋狀體細(xì)胞外液采集及HPLC檢測(cè)

樣品采集。直徑2 mm的微透析探針（CMA，Solan，Sweden）緩慢插入套管，并用封口膜固定。將恒流泵的人工腦脊液（145 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，2.0 mmol/L NaH2PO4，5.4 mmol/L glucose，pH：7.4）流速調(diào)至 2 μL/min，待灌流平衡后，打開(kāi)冷凍收集器收集紋狀體透析液，每次采樣15 min，樣品放于-80℃冰箱待檢測(cè)。

圖2 大鼠自主活動(dòng)能力監(jiān)測(cè)設(shè)備Figure 2.The Rat's Locomotor Behavior Test

Glu濃度檢測(cè)。采用HPLC-熒光法檢測(cè)紋狀體胞外Glu濃度。流動(dòng)相A：0.1 mol/L的KH2PO4溶液，調(diào)節(jié)pH至6.60；流動(dòng)相B：純甲醇（40%恒流洗脫），流速設(shè)為1.0 mL/min，樣品測(cè)試前進(jìn)行OPA柱前衍生。

1.9 運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體神經(jīng)電信號(hào)采集與分析

1.9.1 神經(jīng)電信號(hào)采集

Cerebus-128多通道電生理信號(hào)記錄系統(tǒng)（Cyberkinetics）設(shè)置采樣頻率為1 kHz，低通250 Hz濾波得到局部場(chǎng)電（local field potentials，LFPs）信號(hào)，每次采樣時(shí)間為30 min；并通過(guò)Neuromotive系統(tǒng)（Cyberkinetics，USA）同步追蹤大鼠行為。

1.9.2 LFPs數(shù)據(jù)分析

相干分析（coherence value）。采集的局部場(chǎng)電位LFPs信號(hào)采用希爾伯特（Hilbert）變化提取瞬時(shí)相位（王策群等，2014；Siapas et al.，2005；Sigurdsson et al.，2010），具體方法為如下。

1）給定連續(xù)的時(shí)間信號(hào)S(t)=A(t)ejφs(t)，其中A（t）為信號(hào)的瞬時(shí)振幅，φs（t）為信號(hào)的瞬時(shí)相位；

2）S（t）的希爾伯特變換為（t），用如下公式計(jì)算：

式中，p、v為柯西主值；

3）根據(jù)解析信號(hào)方法求解瞬時(shí)相位：

互相關(guān)分析時(shí)將腦電信號(hào)劃分為n個(gè)時(shí)間段，每個(gè)數(shù)據(jù)段先進(jìn)行窗平滑處理，再對(duì)得到的窗函數(shù)進(jìn)行傅里葉變換。相干函數(shù)由歸一化互譜函數(shù)得到，選取兩個(gè)通道之間振幅、頻率和相位角的一致程度，即皮層和紋狀體兩個(gè)腦區(qū)神經(jīng)電活動(dòng)的相干性情況，以此評(píng)價(jià)LFPs的同步關(guān)系。具體計(jì)算方法如下。

Xn(k)和Yn(k)分別代表皮層和紋狀體第n次實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)通道，X和YLFPs功率譜GXX(k)和GYY(k)及互譜GXY(k)的計(jì)算公式如下：

其中，k與頻率分量fk的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：fk=kfs/M，式中，fs為采樣率，M為每小段時(shí)間段內(nèi)采樣點(diǎn)數(shù)。

CXY(k)為相干系數(shù)，取值范圍為0～1。當(dāng)相干系數(shù)趨于0時(shí)，表明兩通道LFPs在fk頻率相干度較低，即二者相互獨(dú)立；相干系數(shù)趨于1時(shí)，說(shuō)明兩導(dǎo)LFPs在fk頻率段節(jié)奏趨于一致。

相位同步指數(shù)（coherence phase index）。相位同步指數(shù)適用于評(píng)價(jià)窄帶頻域的相位同步化程度，此算法可以排除信號(hào)幅度的影響，只從相位上考察兩個(gè)信號(hào)之間的同步性（Kondabolu et al.，2016；Pittman-Polletta et al.，2018；Rohenkohl et al.，2018），算法如下。

1）對(duì)兩導(dǎo)信號(hào)x1(t)和x2(t)進(jìn)行Hilbert變換，求取瞬時(shí)相位φ1(t)和φ2(t)；

2）求取φ1(t)和φ2(t)的相位差，并取一段進(jìn)行平均，求其相位同步值PLV：

式中，|?|表示復(fù)數(shù)的模；N為取樣點(diǎn)的總數(shù)。相位同步指數(shù)PLV取值范圍在0～1之間，PLV是0時(shí)，兩LFPs之間無(wú)任何相位同步；當(dāng)PLV是1時(shí)，兩LFPs之間有穩(wěn)定的相位差，即兩LFPs間的相位同步。

1.9.3 電生理組織切片定位

所有試驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠用4%多聚甲醛灌流、取腦，包埋后切片（50 μm），進(jìn)行尼氏染色和組織定位（圖3）。剔除運(yùn)動(dòng)能力差、造?；蚴中g(shù)失敗的大鼠后，共24只大鼠進(jìn)入最后電生理數(shù)據(jù)分析。

1.10 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

采用Sigmaplot 13.0做圖，SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。各組間數(shù)據(jù)差異性用單因素方差分析（One way ANOVA），各組行為學(xué)數(shù)據(jù)隨時(shí)間變化的差異性用重復(fù)測(cè)量方差（Repeated ANOVA）分析，各組電生理數(shù)據(jù)的功率譜密度（power spectral density，PSD）值采用可重復(fù)雙因素方差（two-factor with replication）分析，組間、組內(nèi)百分比分析用卡方檢驗(yàn)，相干系數(shù)與相關(guān)系數(shù)組間、組內(nèi)比較用U檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 運(yùn)動(dòng)皮層和紋狀體電極位點(diǎn)組織切片定位Figure 3.The Location of Electrode Tract in the Motor Cortex and Striatum

2 結(jié)果

2.1 PD模型可靠性評(píng)價(jià)

染毒后第7天進(jìn)行APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試，結(jié)果顯示，Control組大鼠未出現(xiàn)異常旋轉(zhuǎn)行為，PD模型組大鼠共41只凈旋轉(zhuǎn)次數(shù)＞100轉(zhuǎn)/30 min（152.37±15.41/30 min），符合模型判定標(biāo)準(zhǔn)。

第4周行為測(cè)試結(jié)束后進(jìn)行免疫組化取材及染色，結(jié)果顯示，Control組大鼠兩側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞均勻、對(duì)稱(chēng)分布，PD模型組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量（圖4A）和紋狀體TH陽(yáng)性纖維數(shù)量（圖4B）顯著減少，雙側(cè)呈現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)性。Control組大鼠黑質(zhì)與紋狀體TH陽(yáng)性表達(dá)均無(wú)顯著性改變（P＞0.05），與Control組相比，PD組黑質(zhì)DA能神經(jīng)元丟失達(dá)90%以上（0.97±0.05vs.0.06±0.02，P＜0.01），紋狀體TH陽(yáng)性纖維含量丟失達(dá)到85%以上（0.23±0.02vs.1.07±0.08，P＜0.01）；PD+Ex組黑質(zhì)與紋狀體TH陽(yáng)性表達(dá)較PD組無(wú)顯著性改變（P＞0.05）；上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)PD大鼠模型成功（圖4C、D）。

2.2 自主活動(dòng)能力測(cè)試結(jié)果

自主活動(dòng)能力測(cè)試結(jié)果顯示，3組大鼠自主活動(dòng)能力存在明顯差異（圖5A），與Control組相比，PD組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離顯著減少（P＜0.01），且在中心區(qū)域停留較少；與PD組大鼠相比，PD+Ex組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離顯著增加（P＜0.05），但仍少于Control組（P＜0.05，圖5B）。對(duì)3組大鼠各周行為測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較，與第0周相比，Control組大鼠各周總運(yùn)動(dòng)距離無(wú)顯著變化（P＞0.05）；PD組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離有逐漸下降趨勢(shì)，僅第4周出現(xiàn)顯著減少（P＜0.05）；PD+Ex組第1周總運(yùn)動(dòng)距離出現(xiàn)增加趨勢(shì)，第3周顯著增加（P＜0.05），第4周極顯著增加（P＜0.01，圖5C）。

圖4 黑質(zhì)和紋狀體TH免疫組化結(jié)果Figure 4.TH Immunostaining Results in the Striatum and SNc

大鼠各種狀態(tài)時(shí)間占比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與Control組相比，PD組快速移動(dòng)和慢速移動(dòng)時(shí)間占比均顯著減少（P＜0.01，P＜0.05），而安靜狀態(tài)時(shí)間明顯增加（P＜0.01）；與PD組相比，PD+Ex組快速移動(dòng)和慢速移動(dòng)時(shí)間占比均明顯提升（P＜0.05），而安靜狀態(tài)時(shí)間占比顯著降低（P＜0.05），但快速移動(dòng)時(shí)間仍低于 Control組（P＜0.05，圖5D）。

圖5 自主活動(dòng)行為測(cè)試結(jié)果Figure 5.Locomotor Behavior Results

2.3 運(yùn)動(dòng)皮層和紋狀體LFPs功率頻譜分析

與Control組比較，PD組大鼠運(yùn)動(dòng)皮層低頻振蕩和中頻振蕩的能量明顯增高；與PD組比較，PD+Ex組運(yùn)動(dòng)皮層中高頻段（約8～35 Hz）能量帶減弱，但仍強(qiáng)于Control組（圖6）。

圖6 各組大鼠運(yùn)動(dòng)皮層LFPs的功率頻譜圖Figure 6.Power Spectral Density of LFPs in Motor Cortex

與Control組相比，PD組大鼠紋狀體內(nèi)（8～35 Hz）振蕩能量帶明顯增強(qiáng)，PD+Ex組較PD組有一定減弱，但仍強(qiáng)于Control組（圖7）。

2.4 運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體β振蕩同步性分析

采用matlab軟件進(jìn)行PSD數(shù)據(jù)處理與分析后發(fā)現(xiàn)，PD大鼠運(yùn)動(dòng)皮層和紋狀體內(nèi)10～30 Hz的β頻段功率譜密度PSD出現(xiàn)異常增高（圖8C），運(yùn)動(dòng)干預(yù)后PD大鼠運(yùn)動(dòng)皮層和紋狀體β頻段PSD值降低（圖8D）。

采用相干分析與相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，PD組和PD+Ex組運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體β振蕩的相干系數(shù)顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）；PD+Ex組較PD組顯著降低（P＜0.05，圖9A）；相位同步指數(shù)與相干系數(shù)結(jié)果相一致（圖9B）。組內(nèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control組相干系數(shù)第1、2、3、4周與第0周比均無(wú)顯著差異（P＞0.05），PD+Ex組第1、2周相干指數(shù)與第0周比無(wú)顯著差異（P＞0.05），第3周較第0周顯著下降（P＜0.05），第4周極顯著降低（P＜0.01），PD組第4周較第0周相干系數(shù)顯著增高（P＜0.05，9C）；相位同步指數(shù)各組大鼠隨時(shí)間變化的趨勢(shì)與相干系數(shù)相同（圖9D）。

圖7 各組大鼠紋狀體LFPs功率頻譜圖Figure 7.Power Spectral Density of LFPs in Striatum

圖8 大鼠運(yùn)動(dòng)皮層--紋狀體LFPs及PSD結(jié)果Figure 8.Power Spectral Density and LFPs in Motor Cortex and Striatum

2.5 紋狀體Glu濃度檢測(cè)結(jié)果和mGluR2/3蛋白表達(dá)

3組大鼠HPLC結(jié)果顯示，與Control組相比，PD組和PD+Ex組紋狀體胞外Glu濃度均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），但PD+Ex組較PD組顯著降低（P＜0.01，圖10A）。WB分析結(jié)果顯示，PD組和PD+Ex組mGluR2/3蛋白水平均較Control組顯著下調(diào)（PD：P＜0.01，PD+Ex：P＜0.05，圖10B），PD+Ex組mGluR2/3蛋白水平顯著高于PD組（P＜0.01）。

3 討論

皮層和基底神經(jīng)節(jié)是哺乳類(lèi)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為調(diào)控的重要中樞。紋狀體作為皮層向基底神經(jīng)節(jié)信息輸入腦區(qū)，主要負(fù)責(zé)神經(jīng)信息的整合與編碼，并通過(guò)直接與間接通路調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)發(fā)起與停止、動(dòng)作的協(xié)調(diào)性與精確性。皮層-基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路內(nèi)多頻段同步振蕩活動(dòng)能夠量化空間上分離的神經(jīng)元在時(shí)間上的功能性連接強(qiáng)度，被認(rèn)為是哺乳類(lèi)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和技能學(xué)習(xí)過(guò)程中大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信息加工的重要機(jī)制，也是腦功能連接狀態(tài)的主要生理表現(xiàn)形式之一（Schroll et al.，2016；Wichmann et al.，2010）。

3.1 PD模型大鼠運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能性連接異常

PD病理狀態(tài)下，紋狀體神經(jīng)元電活動(dòng)改變?cè)诼樽砼c清醒PD動(dòng)物模型的研究中均已被證實(shí)（Chen et al.，2018；Delaville et al.，2014；Lozovaya et al.，2018）。Oswal等（2013）、Brittain等（2014）、De等（2019）、Delaville等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，PD動(dòng)物運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元出現(xiàn)異常β振蕩，且經(jīng)基底神經(jīng)節(jié)各核團(tuán)逐級(jí)放大，同時(shí)伴隨振蕩的同步性增強(qiáng)，這可能是導(dǎo)致動(dòng)作遲緩和自主活動(dòng)減少的病理基礎(chǔ)。長(zhǎng)期使用左旋多巴藥物治療引起PD動(dòng)物丘腦底核神經(jīng)元β振蕩增強(qiáng)也與異動(dòng)癥發(fā)病有關(guān)（Alonsofrech et al.，2006；Picconi et al.，2018）。Sanabria等（2017）、Brown等（2005）認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)皮層-基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路多個(gè)核團(tuán)出現(xiàn)β振蕩同步性增強(qiáng)是PD患者及動(dòng)物腦功能連接異常的表現(xiàn)形式之一。本研究也發(fā)現(xiàn)，PD模型大鼠運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體β振蕩異常增高，且之間的相干系數(shù)和相位同步指數(shù)顯著增加，振蕩的同步性增強(qiáng)，表明運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接增強(qiáng)，與上述研究結(jié)果一致。

圖9 運(yùn)動(dòng)皮層--紋狀體β振蕩的同步性分析Figure 9.Results of Synchronization in Corticostriatal β Oscillation

圖10 紋狀體胞外Glu濃度和mGluR2/3表達(dá)水平Figure 10.Extracellular Glutamate Levels and mGluR2/3 Expression in Striatum

腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DA損耗后，皮層-紋狀體Glu能突觸的興奮性突觸后場(chǎng)電位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）顯著升高，表明該通路突觸傳遞增強(qiáng)（Edouard et al.，2016）。皮層神經(jīng)元Spike-LFPs耦合增加，Glu釋放增多，紋狀體MSNs突觸前、后膜Glu受體活性改變，可能均是導(dǎo)致PD狀態(tài)皮層-紋狀體通路突觸傳遞增強(qiáng)的原因（Damodaran et al.，2014；Warre et al.，2011）；皮層-紋狀體興奮性Glu能突觸的同步活動(dòng)疊加是通路功能連接可塑性的基礎(chǔ)。由此推測(cè)，皮層-紋狀體運(yùn)動(dòng)調(diào)控通路的驅(qū)動(dòng)異常與PD大鼠行為障礙和自主活動(dòng)減少有關(guān)。

3.2 運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)PD模型大鼠運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接可塑性

規(guī)律運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)腦的神經(jīng)可塑性已經(jīng)成為共識(shí)。Li等（2012）、Steib等（2019）研究證實(shí)，太極拳、跑步機(jī)等多種運(yùn)動(dòng)形式均能改善PD患者的行為功能障礙；本研究及前期的研究均證明，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可明顯改善PD大鼠的自主活動(dòng)行為、步態(tài)、平衡和協(xié)調(diào)能力（時(shí)凱旋等，2017）。采用在體電生理學(xué)技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)降低了PD模型大鼠運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路β振蕩的同步性，重塑了該通路功能連接可塑性；且發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接可塑性改變與PD模型大鼠自主活動(dòng)行為改善均存在類(lèi)似的時(shí)間依賴(lài)關(guān)系；基于此，運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接的運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性增強(qiáng)可能是改善PD大鼠自主活動(dòng)行為的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制的假說(shuō)。

研究發(fā)現(xiàn)，早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用可降低PD模型大鼠皮層-紋狀體通路Glu的興奮性毒作用，糾正由于紋狀體內(nèi)DA和Glu失衡導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)通路的功能紊亂（Shi et al.，2017，2019）；利用腦片膜片鉗和免疫印跡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可降低PD動(dòng)物皮層-紋狀體Glu突觸傳遞（趙剛等，2019）；Glu興奮性驅(qū)動(dòng)減弱使MSNs適當(dāng)去同步化，使皮層-紋狀體通路對(duì)信息整合處理的功能得到改善。Lee等（2018）、Elena等（2018）通過(guò)損毀蒼白球或電刺激丘腦底核的方法，降低運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路β振蕩的同步性也達(dá)到改善PD行為功能的效果。因此，運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接的運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性增強(qiáng)可能是改善PD大鼠自主活動(dòng)行為的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制之一。

3.3 Glu興奮性傳導(dǎo)參與皮層-紋狀體通路運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性的調(diào)節(jié)

Glu作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體突觸可塑性的調(diào)節(jié)。Glu由突觸前釋放，激活突觸后膜上的離子型Glu受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA），觸發(fā)Ca2+等陽(yáng)離子內(nèi)流介導(dǎo)的突觸后神經(jīng)元去極化，產(chǎn)生動(dòng)作電位或局部場(chǎng)電位。PD病理狀態(tài)下，由于缺乏DA調(diào)節(jié)的內(nèi)在K+電流，會(huì)增加皮層-紋狀體突觸Glu興奮性突觸后電位（excitatory postsynaptic potentials，EPSP）傳入，趨使紋狀體較多MSNs興奮，導(dǎo)致皮層-紋狀體通路β振蕩的同步性增強(qiáng)（Lozovaya et al.，2018）。mGluR2/3位于運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體突觸前膜，作為突觸前異源性受體調(diào)控Glu釋放，同時(shí)還作為自身受體抑制電壓門(mén)控鈣通道（voltage gated calcium channel，VGCC）活化，降低Glu突觸興奮性傳導(dǎo)（圖11），已被認(rèn)為是調(diào)控皮層-紋狀體Glu突觸信息傳遞和功能可塑性的重要細(xì)胞靶分子。

6-OHD染毒大鼠紋狀體mGluR2/3表達(dá)下調(diào)，引起胞外Glu濃度增高；給予mGluR2/3激動(dòng)劑抑制Glu釋放，可抑制皮層-紋狀體Glu突觸的過(guò)度傳導(dǎo)，減輕Glu的興奮性毒作用（Conn et al.，2005）。此外，PD模型大鼠紋狀體mGluR2/3表達(dá)下調(diào)引起Glu興奮性毒作用增強(qiáng)與紋狀體MSNs樹(shù)突棘脫落密切相關(guān)（Garcia et al.，2010；Murray et al.，2002）。有研究提出，激活mGluR2/3促進(jìn)MSNs樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)可塑性，可能是抑制PD皮層-基底神經(jīng)節(jié)通路功能連接強(qiáng)度的潛在細(xì)胞分子機(jī)制（Lovinger et al.，1995；Picconi，2002）。本研究發(fā)現(xiàn)，4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)上調(diào)mGluR2/3表達(dá)并降低紋狀體胞外Glu濃度，表明mGluR2/3介導(dǎo)的Glu興奮性傳遞參與了PD大鼠運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，提示mGluR2/3可能是調(diào)控運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性的重要細(xì)胞分子靶點(diǎn)。后續(xù)將擬選用D2-Cre或D1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)紋狀體注入興奮性光敏感蛋白或抑制性光敏感蛋白病毒，利用全細(xì)胞膜片鉗結(jié)合光遺傳技術(shù)精準(zhǔn)激活皮層-紋狀體突觸前膜上的mGluR2/3，實(shí)現(xiàn)對(duì)D1-MSNs和D2-MSNs興奮性的調(diào)控，并從胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及VGCC活性水平揭示mGluR2/3調(diào)控PD小鼠皮層-紋狀體通路運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性的細(xì)胞分子機(jī)制，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究提出的假設(shè)。

圖11 mGluR2/3對(duì)皮層--紋狀體突觸傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)Figure 11.The Regulation of mGluR2/3 in Corticostriatal Synaptic Transmission

4 結(jié)論

PD模型大鼠自主活動(dòng)行為降低伴隨運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接異常。運(yùn)動(dòng)干預(yù)通過(guò)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接有效改善PD模型大鼠自主活動(dòng)行為。運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體通路功能連接的運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性增強(qiáng)可能是改善PD大鼠自主活動(dòng)行為的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制之一，mGluR2/3受體介導(dǎo)的Glu興奮性傳遞參與了這一過(guò)程。