培養(yǎng)瓶制備腺病毒的收率研究

王愛霞 薛亮 胡國棟

摘 要 在293細胞培養(yǎng)體系中感染腺病毒后，分別培養(yǎng)48、72或96 h時收獲病毒，比較產(chǎn)量和活性，結(jié)果表明培養(yǎng)72 h是高產(chǎn)的最佳收獲時機；并討論了毒種制備的規(guī)模、后續(xù)使用特點對制備方法的限制。

關(guān)鍵詞 293細胞 腺病毒 毒種制備 病毒收獲 非完全釋放 完全釋放

中圖分類號：Q813.11 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）15-0083-03

Improvement of the process for adenovirus production

WANG Aixia*， XUE Liang， HU Guodong

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT After infection with adenovirus in 293 cell culture system， adenovirus was harvested from 48 h， 72 h and 96 h culture， respectively. The yield and activity of the adenovirus were compared， and the optimum harvest time for high yield adenovirus was judged to be 72 h. The limitations of the scale of adenovirus preparation and the characteristics of subsequent use on the preparation were discussed.

KEY WORDS 293 cell； adenovirus； virus preparation； virus harvest； incomplete release； complete release

隨著過去幾十年生物制藥的普及和發(fā)展，行業(yè)內(nèi)的腺病毒從實驗室到臨床對有著廣泛的研究，包括溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus）、腺病毒疫苗（adenovirus vaccine）和腺病毒基因載體（adenovirus gene therapy）。溶瘤腺病毒因E1B缺失，在正常的體細胞內(nèi)不能復(fù)制，并且病毒基因組存在于細胞染色體外，不整合到細胞染色體中，避免了因整合引起的基因突變及激活致癌基因，對人體生物安全性高，所以腺病毒是目前研究進展最快的溶瘤病毒之一[1-3]。目前，腺病毒溶瘤性或基因轉(zhuǎn)導(dǎo)作用廣泛被用于癌癥治療領(lǐng)域[4]，其中溶瘤腺病毒有一個品種已上市（安柯瑞），6個品種處于臨床Ⅱ期，11個品種處于臨床Ⅰ期研究；溶瘤腺病毒疫苗有6個處于臨床Ⅱ期，3個品種處于臨床Ⅰ期研究；溶瘤腺病毒基因載體有2個品種處于臨床3期，5個品種處于臨床Ⅱ期，3個品種處于臨床Ⅰ期研究。

腺病毒可感染的細胞種類多，宿主范圍廣，幾乎可以感染所有類型的細胞。且外源基因表達水平較高，易于制備出大量高滴度的病毒，因此被廣泛運用于產(chǎn)業(yè)化。未來業(yè)界基礎(chǔ)研究的方向應(yīng)強化溶瘤腺病毒免疫學(xué)相關(guān)機制的研究、突破妨礙溶瘤腺病毒研究的一些技術(shù)性瓶頸、優(yōu)化細胞載體、提高溶瘤腺病毒收率和活性等[5-13]。

本研究針對完全釋放收獲方式，對腺病毒種子庫擴增技術(shù)進行了研究和分析，并討論了行業(yè)內(nèi)關(guān)注的腺病毒釋放、收獲時機的把控及產(chǎn)量規(guī)模對收獲方式的限制，以期為提高病毒種子產(chǎn)量和后期適用性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

293細胞（中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心）；5型腺病毒（上海三維生物技術(shù)有限公司）；175 cm2細胞培養(yǎng)瓶（丹麥Nunc公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；DMEM高、低糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；J-25冷凍離心機（JA-10轉(zhuǎn)子，貝克曼庫爾特公司）；-80℃冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

293細胞復(fù)蘇后，在175 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，放入二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，72 h后觀察復(fù)蘇結(jié)果，如果生長正常（無污染、無脫落、容器無破損、鏡檢視野下細胞生長率達80%以上），可用于傳代。

通常傳代后48 h即可長滿，用于繼續(xù)傳代，等傳代至所需的數(shù)量備用感染病毒。

1.2.2 病毒收獲

取生長良好的細胞，以1∶5～1∶20感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的比例接入腺病毒，在2%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱、37 ℃培養(yǎng)，分別于48、72、96 h左右收獲病毒液。

用力拍打細胞培養(yǎng)瓶，使細胞瓶底面上未脫落的細胞受震蕩后脫落懸浮于培養(yǎng)液中。在生物安全柜中將瓶內(nèi)懸液移入適當?shù)臒o菌離心管內(nèi)，離心（4 000 r/min，10 min，2～8 ℃），分別收獲上清液和沉淀物（細胞碎片）。沉淀物中加入10～25 ml 2%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液于-80 ℃冰箱凍結(jié)后，于室溫融化，反復(fù)凍融3次。凍融后的懸液離心（8 000 r/min，10 min，2～8 ℃）收集上清液，按使用體積要求分裝、凍存。如制備的病毒用于繼續(xù)擴增，均須在無菌條件下操作。

1.2.3 病毒檢測

對凍融前上清液和凍融后的上清液分別取樣檢測病毒顆粒數(shù)和活性。用顆粒數(shù)檢測和病毒活性檢測（TCID50）來觀察改進后單批次病毒的產(chǎn)量及活性變化[14]。

2 結(jié)果

腺病毒從接入293細胞培養(yǎng)系統(tǒng)后，病毒感染宿主細胞需要經(jīng)過一個完整的復(fù)制周期，包括病毒的吸附、穿入細胞內(nèi)、脫殼、生物合成、病毒顆粒的裝配、釋放等過程，這個過程約48～96 h[15-16]。

2.1 病毒收率

48 h培養(yǎng)物離心前的上清液中沒有檢測出病毒顆粒（小于108 vp/ml），而凍融后上清液中病毒顆粒數(shù)為5.11×1013 vp（表1），說明培養(yǎng)48 h左右收獲時，病毒主要存在于培養(yǎng)細胞內(nèi)，此時并不是病毒產(chǎn)量的高峰期。

72 h收獲離心前的上清液中檢測到的病毒顆粒數(shù)為 7.5×1013 vp（表1），占最終病毒產(chǎn)量的71.6%，說明病毒已經(jīng)裝配完成并釋放至懸液中，但仍有部分病毒在細胞碎片里未釋放。72 h培養(yǎng)物中病毒收獲最終產(chǎn)量達到10.5×1013 vp，與96 h培養(yǎng)物的病毒產(chǎn)量相近，因此72 h培養(yǎng)是病毒產(chǎn)量的高峰期。

96 h收獲離心前的上清液中檢測到的病毒顆粒數(shù)為10.7×1013 vp，與最終收獲的病毒顆粒數(shù)相同，表明病毒已完全釋放至上清液中，且病毒顆粒數(shù)相較72 h培養(yǎng)物沒有明顯提高。

2.2 病毒活性

72 h和96 h培養(yǎng)物凍融前上清液中病毒總活性均高于凍融后上清液，96 h培養(yǎng)物凍融前上清液中病毒總活性明顯低于72 h（表1）。表明細胞外的培養(yǎng)體系可影響病毒活性，且隨著病毒釋放至培養(yǎng)液中的時間延長，活性會進一步降低。

72 h與48 h培養(yǎng)物凍融后離心上清液的病毒單位活性相同，因此72 h培養(yǎng)物在病毒收率提高的同時，活性仍保持在48 h培養(yǎng)物的水平；而96 h培養(yǎng)物中病毒單位活性明顯降低。

2.3 病毒活性比值

72 h收獲的凍融后離心上清液樣品病毒活性比值為13∶1，優(yōu)于48 h和96 h收獲樣品的16∶1和17∶1，而72 h收獲的凍融前病毒活性比值（10∶1）最優(yōu)（表1）。

3 討論

腺病毒感染后，可分為非完全釋放收獲和完全釋放收獲。以上述實驗為例，48 h收獲為非完全釋放收獲，收獲的具體方法可以包括物理方法如凍融，超聲破碎或低滲透壓等，以及化學(xué)方法如使用表面活性劑來裂解細胞，使病毒從細胞總釋放到營養(yǎng)液中，達到收獲病毒的目的；72 h和96 h為完全釋放收獲，此時，病毒依靠本身裂解細胞的能力將大部分病毒釋放到培養(yǎng)液，可直接從培養(yǎng)上清液中收獲病毒。從實驗結(jié)果來看，如果在72 h收獲時只獲取上清液（即凍融前上清液），不再對細胞進行反復(fù)凍融，可以得到病毒產(chǎn)量為7.5×1013 vp，病毒總活性為7.3×1012 TCID50，且病毒活性比值為10∶1的樣品，與48 h收獲相比，省去了裂解細胞和提取病毒的操作，而病毒收率和活性有顯著增加。因此從收獲產(chǎn)量、活性角度選擇，完全釋放收獲的方式效率更高。

在腺病毒實驗室研究和生產(chǎn)實踐中，非完全釋放收獲方式也有著廣泛的應(yīng)用，它可濃縮制備后病毒庫的體積。非完全釋放收獲（48 h）時，收獲的培養(yǎng)液上清中并未檢出病毒，因此可通過離心的方式去除收獲液內(nèi)被消耗營養(yǎng)成分及呈酸性的培養(yǎng)液，加入適量新鮮的培養(yǎng)液至離心后收集的細胞碎片，重懸凍融后可獲得濃縮后的毒種。非完全收獲方式一方面可以避免培養(yǎng)液產(chǎn)生的酸性環(huán)境導(dǎo)致病毒的衣殼裂解而對病毒的擴增及最終的活性起到的負面作用，另一方面加入的新鮮培養(yǎng)液中不含有胎牛血清，避免了培養(yǎng)體系中引入動物源性蛋白的風(fēng)險。此外，在此過程中不需要額外的設(shè)備和病毒純化工藝介入，可以滿足實驗室規(guī)模的生產(chǎn)，進行臨床前或臨床階段的相關(guān)實驗。

完全釋放收獲（72 h）也有不足之處，收獲時大部分病毒已經(jīng)釋放至上清中，在不能有效分離的前提下，收獲后的毒種庫體積較龐大，假設(shè)用100個175 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)腺病毒，每瓶25 ml培養(yǎng)體積，那么毒種總體積在2.5 L左右，而病毒濃度相對較低，這對于毒種庫后期使用有著較大的困難，需要對收獲液進行濃縮和培養(yǎng)液置換，增加對應(yīng)的設(shè)備和工藝流程，也增加了收率損耗及產(chǎn)業(yè)化過程中的成本。在長滿細胞準備感染病毒的反應(yīng)罐或其他大規(guī)模擴增容器中，加入較大體積含有營養(yǎng)成分被消耗枯竭并有細胞代謝的酸性物質(zhì)的培養(yǎng)液，會對病毒感染早期的細胞生長有著很大的負面影響，可能直接導(dǎo)致病毒產(chǎn)率下降或失敗。

完全釋放（96 h）收獲有同樣大的收獲體積，相對72 h收獲的產(chǎn)量相當，但病毒活性已經(jīng)大大下降，因為病毒沒有獨立代謝的能力，在96 h左右，體系中的宿主細胞已經(jīng)消耗殆盡，腺病毒也逐漸失活。此時收獲，只能得到體積大、感染力較低的病毒液。假設(shè)在病毒培養(yǎng)過程中不斷置換培養(yǎng)液，并將置換出的培養(yǎng)液冷藏儲存，有可能在保持病毒活性的情況下最大限度地收獲病毒量，這需要對培養(yǎng)瓶進行額外的設(shè)計，且病毒收獲液體積也將進一步擴大，因此在產(chǎn)業(yè)化過程中需要進行成本考量。

綜上所述，本研究進行了利用培養(yǎng)瓶制備腺病毒的收獲時機的把握考察，不僅僅在于注重收獲產(chǎn)量，也要考慮病毒庫制備的方法對后一階段的使用的限制[10，17 ]。非完全釋放收獲方式制備毒種，相當于胞內(nèi)收獲，雖然收率較低，但其優(yōu)點在于體積可控，濃度較高，宿主細胞的代謝產(chǎn)物殘留少，可用于后續(xù)大規(guī)模反應(yīng)器高密度培養(yǎng)。完全釋放收獲方式制備毒種的優(yōu)勢在于收率較高，但在不做體積濃縮和緩沖體系置換的前提下，只適合作為體積、產(chǎn)量較小的高代次中間毒種庫的制備。

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