新型尿液標(biāo)志物在紫癜性腎炎患兒中的水平變化

馬一飛，李玉峰，郭桂梅，朱亞菊，龔瑩靚，董 瑜

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院小兒腎臟內(nèi)科，上海 200092

過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是兒童常見的血管炎，是兒童繼發(fā)性腎臟疾病的常見原因之一。HSP 引起的紫癜性腎炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是影響預(yù)后的主要因素，嚴(yán)重者可進(jìn)展為終末期腎功能不全[1]。臨床上評(píng)估HSP 腎臟損害主要依賴于腎活檢，但由于腎活檢為有創(chuàng)操作，患者重復(fù)檢測的依從性較差。因此通過尿液標(biāo)志物來評(píng)估HSPN 的嚴(yán)重程度具有重要意義。近年來的研究[2]表明，血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）活化在腎臟病進(jìn)展過程中十分重要；尿血管緊張素原（urinary angiotensinogen，UAGT）可以反映腎臟局部RAS 活化程度。成纖維細(xì)胞特異蛋白-1（fibroblast-specific protein-1，F(xiàn)SP-1）是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，反映腎小管上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化水平[3]，在HSPN 疾病發(fā)展中非常重要。尿凝血酶（thrombin）可反映新月體腎炎炎癥水平及腎臟局部凝血活動(dòng)中的作用[4]。

本研究通過檢測新型尿液標(biāo)志物UAGT、FSP-1 及尿凝血酶在尿檢正常兒童、HSP 患兒和HSPN 患兒中的水平，及在不同治療階段的HSPN 患兒中的水平，初步探討3 種新型尿液標(biāo)志物在HSPN 診斷及療效評(píng)估中的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及其臨床資料

選取2016 年4 月—2019 年10 月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院小兒腎臟內(nèi)科收治的HSPN 患兒（HSPN組，n=14）、尿檢正常的HSP 患兒（HSP 組，n=28）及尿檢正常的兒童（對(duì)照組，n=23）。HSPN 患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟病學(xué)組發(fā)布的《紫癜性腎炎的診治循證指南（2016）》；在排除合并心血管系統(tǒng)疾病、慢性肝腎疾病、其他風(fēng)濕性疾病、泌尿系統(tǒng)感染等疾病的同時(shí)，均行腎穿刺活檢術(shù)明確腎臟病理改變，且腎小球病理分級(jí)均為Ⅲ級(jí)以上，即病理檢查提示系膜增生，伴有＜50%腎小球新月體形成和（或）節(jié)段性病變（硬化、粘連、血栓、壞死），其系膜增生又分為局灶/節(jié)段和彌漫性[5]。HSPN 組患兒均尚未經(jīng)過治療。HSP 患兒的診斷根據(jù)歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟和歐洲兒童腎臟病防治委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[6]，表現(xiàn)為孤立性皮膚白細(xì)胞增生性血管炎，即具有典型過敏性紫癜皮疹，可合并關(guān)節(jié)或腹部癥狀，排除腎臟受累癥狀，如蛋白尿、血尿。另選取尿檢正常，排除過敏性紫癜及其他血管炎診斷的兒童作為對(duì)照組。

選取同一時(shí)期入院進(jìn)行治療的HSPN 患兒，治療方案采取糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）聯(lián)合免疫抑制劑，具體方案為甲潑尼龍（methylprednisolone）沖擊治療[15 ～30 mg/ （kg·d），靜脈滴注，每日最大劑量不超過1.0 g，隔天給藥，3 次后間隔1 周為1 個(gè)療程，共2 個(gè)療程]，聯(lián)合環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）序貫沖擊治療[8 ～12 mg/ （kg·d），靜脈滴注，連續(xù)給藥2 d 后間隔2 周為1 個(gè)療程，共6 個(gè)療程]。根據(jù)不同的治療階段，將HSPN 患兒分為未治療組10 例、GC 組（GC 沖擊治療2 個(gè)療程結(jié)束）9 例、GC+CTX 組（GC 沖擊治療2個(gè)療程聯(lián)合CTX 序貫沖擊治療6 個(gè)療程結(jié)束）8 例，各組患兒之間無重復(fù)病例。收集以上患兒的性別、年齡、體質(zhì)量等基本信息以及入院當(dāng)天的血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白定量、新月體指數(shù)等指標(biāo)。

患兒入院當(dāng)天均留取新鮮晨尿5 mL，于4 ℃下1 308×g 離心15 min，收集上清液凍存于-80 ℃，用于UAGT、FSP-1、尿凝血酶的檢測（部分患兒未檢測尿凝血酶）。所有入組尿樣均獲得入選對(duì)象監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 UAGT、FSP-1、尿凝血酶及尿肌酐檢測

尿肌酐（urinary creatinine，Ucr）采用全自動(dòng)生化分析儀（7600，日本Hitachi）檢測。UAGT 檢測試劑盒購自日本IBL 公司（貨號(hào)27412），尿FSP-1 檢測試劑盒購自日本MBL 公司（貨號(hào)CY-8086），尿凝血酶檢測試劑盒購自中國武漢華美公司（貨號(hào)CSB-E14235h）。具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單個(gè)樣本K-S 檢驗(yàn)正態(tài)分布。正態(tài)分布的定量資料采用±s 表示；若符合方差齊性，則組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法；若方差不齊，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的定量資料，采用M（Q1，Q3）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。定性資料用頻數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

在不同疾病患兒一般資料的比較中，HSPN 組患兒14 例，年齡（10.00±2.04）歲；HSP 組患兒28 例，年齡（6.11±2.48）歲；對(duì)照組兒童23 例，年齡（5.17±3.10）歲。其中HSPN 組患兒的年齡大于其他2 組，血肌酐和體質(zhì)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但3 組間性別比、血尿素氮差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （表1）。

表1 HSPN 組、HSP 組患兒和對(duì)照組兒童一般資料的比較Tab 1 Comparison of the general information among HSPN group, HSP group and control group

在HSPN 不同治療階段患兒基線資料（治療前）的比較中，未治療組10 例，年齡（10.03±2.05）歲；GC組9 例，年齡（8.67±2.45）歲；GC+CTX 組8 例，年齡（8.88±2.59）歲。3 組患兒治療前基線資料的各項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 未治療組、GC 組和GC+CTX 組HSPN 患兒基線資料的比較Tab 2 Comparison of the general information among untreated group, GC group and GC+CTX group

2.2 HSP 累及腎臟時(shí)UAGT、FSP-1 和尿凝血酶水平的變化

分別檢測HSPN 組、HSP 組患兒和尿檢正常兒童的UAGT、FSP-1 和尿凝血酶水平。由于UAGT 經(jīng)腎小球?yàn)V過，用Ucr 校正UAGT 水平。HSPN 組UAGT/Ucr 和FSP-1均顯著高于HSP 組和對(duì)照組（均P＜0.05），而HSP 組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSPN 組患兒尿凝血酶水平與HSP 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2 組均顯著高于對(duì)照組（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 HSPN 組、HSP 組患兒和對(duì)照組兒童UAGT/Ucr（A）、FSP-1（B）和尿凝血酶（C）的表達(dá)Fig 1 Levels of UAGT/Ucr (A), FSP-1 (B) and thrombin (C) in HSPN group, HSP group and control group

2.3 HSPN 不同治療階段UAGT、FSP-1、尿凝血酶水平及24 h 尿蛋白定量的變化

圖2 未治療組、GC 組和GC+CTX 組HSPN 患兒UAGT/Ucr （A）、FSP-1 （B）、尿凝血酶（C）及24 h 尿蛋白定量（D）水平Fig 2 Levels of the UAGT/Ucr (A), FSP-1 (B), thrombin (C) and 24 h urine protein (D) in untreated group, GC group and GC+CTX group

在HSPN 患兒的不同治療階段，UAGT/Ucr、FSP-1、尿凝血酶和24 h 尿蛋白定量水平均在未治療組最高，GC組和GC+CTX 組均有一定程度的降低，但完成GC 序貫CTX 沖擊治療后僅UAGT/Ucr 和24 h 尿蛋白定量顯著低于未治療組（均P＜0.05），尿凝血酶在3 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FSP-1 在GC 沖擊治療后即較未治療組顯著下降（P＜0.05），但序貫CTX 沖擊治療后反而出現(xiàn)了回升，與未治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

3 討論

HSP 患兒若發(fā)生腎臟損害會(huì)對(duì)其遠(yuǎn)期預(yù)后有較大的影響，少部分HSPN 患兒可進(jìn)展為終末期腎病。目前HSPN的嚴(yán)重度評(píng)估主要依賴于腎活檢，新月體指數(shù)越高，說明損傷程度越嚴(yán)重。及時(shí)動(dòng)態(tài)評(píng)估腎臟損害程度有利于指導(dǎo)臨床開展精準(zhǔn)治療。腎活檢有一定的創(chuàng)傷，臨床上重復(fù)腎活檢依從性差；如有無創(chuàng)、簡便、特異的尿液標(biāo)志物幫助臨床醫(yī)師早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展并盡早干預(yù)，既可改善預(yù)后，又可避免過度治療。

近年來研究發(fā)現(xiàn)了多種與新月體形成相關(guān)的尿液標(biāo)志物。腎臟局部RAS 在腎臟病理生理中起重要作用。腎臟內(nèi)存在完整獨(dú)立的局部RAS[7]，其活化在包含IgA 腎病在內(nèi)的腎病進(jìn)程中至關(guān)重要。血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）主要通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）等的作用轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ型（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）發(fā)揮作用，后者可通過與血管緊張素受體（angiotensin receptors，ATR）結(jié)合，導(dǎo)致腎小球內(nèi)壓升高，腎血流量減少，繼而引起腎小球?yàn)V過率下降，并刺激腎小球系膜細(xì)胞增生、活化和肥大，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生[8-9]。另外Ang Ⅱ可以誘發(fā)、參與炎癥反應(yīng)，并通過影響白細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，改變血管通透性，引起血管炎[10]，并通過激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)、誘導(dǎo)上皮 - 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）介導(dǎo)新月體的形成。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，UAGT 與腎臟內(nèi)Ang Ⅱ染色強(qiáng)度呈正相關(guān)，與血AGT 水平無關(guān)，提示UAGT 可以較好地反映腎臟局部RAS 活性。在本研究中，UAGT/Ucr 在HSPN 組的水平顯著高于HSP 組和對(duì)照組，而后2 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明HSPN 發(fā)病過程中存在局部RAS 活化，導(dǎo)致腎臟局部AGT 水平明顯升高。另HSPN 患兒經(jīng)過GC 和CTX 序貫沖擊治療后，24 h 尿蛋白定量逐步減少，UAGT/Ucr 水平亦隨之下降，可見UAGT/Ucr 水平在評(píng)估病情進(jìn)展和療效上具有一定的價(jià)值。

FSP-1 又稱S1004A 蛋白，是S100 蛋白家族成員之一，分布于人類的成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中，但正常腎臟細(xì)胞中未見表達(dá)。FSP-1 在EMT過程中起重要作用[11-12]。Iwano 等[13]發(fā)現(xiàn)FSP-1 在新月體腎炎患者的尿液中顯著升高，Turnier 等[14]在狼瘡性腎炎患者中亦發(fā)現(xiàn)FSP-1 與新月體指數(shù)及疾病活動(dòng)度有關(guān)。故尿FSP-1 可反映腎臟新月體的形成程度。在本研究中，HSPN 組的FSP-1 水平較HSP 組和對(duì)照組明顯升高，表明HSPN 患兒腎臟損害過程中激活新月體形成，并出現(xiàn)EMT 及纖維化現(xiàn)象。在后續(xù)治療評(píng)估中，GC 沖擊可引起FSP-1 水平明顯下降，但在序貫CTX 沖擊后出現(xiàn)了小幅回升。由于HSPN 患兒在治療后期腎臟的纖維化程度未進(jìn)行病理學(xué)檢查，無法從病理學(xué)角度加以驗(yàn)證。

尿凝血酶與慢性腎臟病關(guān)系密切。早在2004 年，有研究[15]發(fā)現(xiàn)尿凝血酶與腎小球腎炎相關(guān)，反映腎小球腎炎局部凝血過程。2015 年，Kitamoto 等[4]發(fā)現(xiàn)尿凝血酶可反映新月體腎炎的活動(dòng)程度；這可能與腎小球內(nèi)纖維蛋白的沉積有關(guān)，后者可促進(jìn)腎臟局部凝血酶生成，參與腎臟局部細(xì)胞外基質(zhì)代謝調(diào)控，與細(xì)胞外基質(zhì)的完整性密切相關(guān)，而細(xì)胞外基質(zhì)系統(tǒng)的紊亂是新月體形成的重要因素。因此，尿凝血酶可反映腎臟新月體形成以及炎癥活化的程度。在本研究中，尿凝血酶在HSPN 組中水平顯著高于對(duì)照組，但與HSP 組差異不大，提示HSP 患兒無論是否累及腎臟，都可能引起尿凝血酶升高，推測可能與HSP 引起廣泛的血管炎，導(dǎo)致凝血功能異常有關(guān)。另外，尿凝血酶在GC 組及GC+CTX 組患兒中的水平較未治療組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一方面可能提示尿凝血酶與腎臟受損無明顯相關(guān)性，與血管炎關(guān)系更密切；另一方面可能與樣本量較少有關(guān)，需要收集更多的病例資料加以明確。

綜上所述，UAGT/Ucr 和尿FSP-1 可以在一定程度上反映HSP 患兒有無發(fā)生腎臟損害，并有可能對(duì)HSPN 患兒的療效有一定的提示作用。

參·考·文·獻(xiàn)

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