西酞普蘭對抑郁癥患者外周血miRNA-16/5- 羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體 通路的影響

錢時(shí)興，房 圓，孫 琳，仇 琦，林治光，肖世富，李 霞

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心老年科，上海 200030

抑郁癥是一種有明顯的復(fù)發(fā)和慢性化趨向的精神疾病，終生患病率高達(dá)15%～20%[1]。在眾多抑郁癥發(fā)病的生化機(jī)制假說中，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）功能低下是較公認(rèn)的一種觀點(diǎn)。5-HT 是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，使交感神經(jīng)節(jié)前纖維興奮及副交感神經(jīng)節(jié)前纖維抑制，參與多種中樞神經(jīng)活動，如情緒控制、調(diào)節(jié)睡眠、焦慮、酗酒、攝食、性行為等[1]。在中樞系統(tǒng)，上述調(diào)節(jié)作用主要由突觸間隙的5-HT 完成。當(dāng)神經(jīng)元受到刺激興奮時(shí)，細(xì)胞內(nèi)囊泡前移與突觸前膜融合并釋放5-HT 至突觸間隙，作用于突觸后靶細(xì)胞受體或突觸前自身受體。5-HT 與受體結(jié)合發(fā)揮作用后即迅速解離。為防止5-HT 在突觸間隙堆積，其最主要的失活方式是被突觸前膜5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體 （serotonin transporter，SERT）攝取入軸突內(nèi)并再次進(jìn)入囊泡儲存。因此，對于突出間隙的5-HT 而言，SERT 是一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，是5-HT 功能低下假說重要組成部分。目前使用的主流抗抑郁藥物5-HT 再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）也是通過調(diào)節(jié)SERT進(jìn)一步調(diào)控抑郁癥患者中樞5-HT，從而起到抗抑郁作用。

近年來，在5-HT 功能低下假說基礎(chǔ)上，一些研究進(jìn)一步探討了微小RNA（microRNA，miRNA）在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的作用。miRNA 是一類真核生物內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，能夠通過結(jié)合或調(diào)節(jié)特定mRNA 的蛋白翻譯過程調(diào)控基因表達(dá)。miRNA 具有很強(qiáng)的細(xì)胞、組織及疾病特異性[2]，現(xiàn)有多項(xiàng)抑郁相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明miRNA-16 是SSRIs 藥物的治療靶點(diǎn)[3]。SSRIs 類藥物通過miRNA-16 對動物中縫核等腦區(qū)SERT 蛋白的翻譯進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響突觸間隙5-HT 濃度，但此結(jié)論尚缺乏臨床研究證據(jù)。

雖然抑郁癥發(fā)病機(jī)制涉及抑郁癥患者大腦中樞神經(jīng)，但miRNA-16 / SERT 通路相關(guān)指標(biāo)在外周血漿及血小板中均存在，為臨床研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制提供了可能。自發(fā)現(xiàn)外周血血小板和中樞系統(tǒng)的5-HT 能神經(jīng)元都可以釋放5-HT，有相同的囊胞單氨轉(zhuǎn)運(yùn)體和5-HT 受體，編碼SERT 的基因也相同后，臨床研究中反映人類中樞系統(tǒng)5-HT 功能的外周血指標(biāo)多用血小板5-HT 相關(guān)指標(biāo)取代，如血小板內(nèi)5-HT 遞質(zhì)及血小板膜SERT 蛋白。

本研究擬通過檢測服用（艾司）西酞普蘭的抑郁癥患者與未用藥患者的外周血miRNA-16 表達(dá)水平及血小板膜SERT 蛋白水平，探討西酞普蘭對抑郁癥患者外周血miRNA-16/SERT 通路相關(guān)指標(biāo)的影響，希冀為進(jìn)一步探討抑郁癥的病因及建立抑郁癥外周血生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

抑郁癥病例均來源于2012 年3—10 月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心心理咨詢門診的患者，健康對照者來源于附屬精神衛(wèi)生中心的工作人員。

未服藥病例組入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊（第四版）》［Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（Fourth Edition），DSM- Ⅳ］修訂版中抑郁癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前處于發(fā)作期的30 d 內(nèi)且未服藥。② 年齡18 ～65 歲，男女不限。③篩查和基線的漢密爾頓抑郁量表17 項(xiàng)（Hamilton Depression Scale-17 items，HAMD-17）評分＞17 分。④患者本人簽署知情同意書。

藥物治療組入組標(biāo)準(zhǔn)：①抑郁發(fā)作期符合DSM- Ⅳ修訂版抑郁癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。② 單藥服用（艾司）西酞普蘭治療 6 周及以上。③西酞普蘭治療或維持劑量10 ～40 mg，每日1 次（艾司西酞普蘭5 ～20 mg，每日1 次），規(guī)律服藥。④ 年齡18 ～65 歲，男女不限。⑤患者本人簽署知情同意書。

健康對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18 ～65 歲，男女不限。②無抑郁癥病史或其他精神疾病史。③本人簽署知情同意書。④30 d 內(nèi)無用藥史。⑤抽血前3 d 未服用動物血液、內(nèi)臟以及牛蛙、海蜇、菠蘿、香蕉、咖啡、奶酪等影響外周血5-HT 水平的食物。

1.2 隨訪研究流程

在首診完成后對抑郁癥患者的處方進(jìn)行查詢。未服藥的抑郁癥患者45 例中，有14 例醫(yī)師處方予以（艾司）西酞普蘭治療，其余31 例分別被醫(yī)師處方予以氟西汀 （4 例）、帕羅西?。? 例）、舍曲林（12 例）、文拉法辛（6 例）和其他藥物（8 例）治療。與被醫(yī)師處方予以（艾司）西酞普蘭的14 例患者保持約2 周一次的電話聯(lián)絡(luò)進(jìn)行隨訪，于8 周后進(jìn)行第2 次隨訪。

1.3 診斷及評估方法

《DSM- Ⅳ -TR 軸Ⅰ障礙定式臨床檢查》（患者版）[4]為定式診斷工具。HAMD-17 是臨床最常用的抑郁障礙評估工具，用于抑郁嚴(yán)重程度和療效評估。中文版HAMD-17 的Cronbach's α 系數(shù)為0.714，平行效度和結(jié)構(gòu)效度均較理想。共17 個條目，主要采用 0 ～4 分的5 級評分法：0 分為該條目無癥狀，1 分為輕度癥狀，2 分為中度癥狀，3 分為重度癥狀，4 分為極重度癥狀。部分條目為0 ～2 分的 3 級評分法：0 分為該條目無癥狀，1 分為輕至中度癥狀，2 分為重度癥狀。HAMD-17 評分總分＜7 分判斷為無抑郁癥狀，總分＞17 分判斷為存在抑郁癥狀。

1.4 血漿miRNA-16 及血小板SERT 蛋白表達(dá)的檢測

熒光定量PCR 檢測血漿miRNA-16 相對表達(dá)量。取5 mL EDTA 抗凝外周血，充分搖勻，4 ℃下536×g 離心30 min，將取得的血漿置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照miRcute miRNA Isolation Kit 說明書從血漿中提取miRNA。依照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 結(jié)合頸環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照TaqMan 通用試劑盒Ⅱ說明書進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，通過ABI 7500 型PCR 儀測定CT值，每個反應(yīng)重復(fù)3 次。以5 S RNA 為看家基因，按照2-△△CT方法計(jì)算檢測miRNA 的相對表達(dá)水平。

Western blotting 檢測血小板中SERT 蛋白水平。主要試劑：一 抗 為Anti-Serotonin Transporter（AB10514P，CBA 公司），按照說明書稀釋；二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG-HRP（上海西唐公司），工作濃度1:5 000。檢測標(biāo)本上樣量均為校正后的15 μg 血清蛋白。內(nèi)參GAPDH 的稀釋終濃度為1:2 000，上樣量為15 μg。根據(jù)SERT 蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH 條帶灰度的比值，計(jì)算SERT 蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov- Smirnov 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的定量資料以±s 表示；組間樣本的年齡比較采用方差分析，組間性別構(gòu)成比較采用χ2檢驗(yàn)。miRNA-16 采用常用對數(shù)相關(guān)轉(zhuǎn)換使其符合正態(tài)分布，血小板SERT 蛋白相對表達(dá)量符合正態(tài)分布。對正態(tài)分布的資料采用方差分析進(jìn)行組間比較，組間存在差異采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。定性資料以頻數(shù)表示。對于14 例未服藥抑郁癥患者進(jìn)行隨訪，隨訪數(shù)據(jù)和基線數(shù)據(jù)的比較采用配對樣本t 檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間基本資料比較

未服藥病例組入組47 例患者，其中剔除1 例合并精神發(fā)育遲緩患者、1 例原發(fā)性血小板減少患者，最后入組45 例；藥物治療組入組33 例患者，其中剔除1 例不規(guī)律服藥患者，最后入組32 例（其中服用西酞普蘭19 例，艾司西酞普蘭13 例）；健康對照組匹配性別、年齡、文化程度，招募入組32 例。未服藥病例組、藥物治療組、健康對照組之間性別、年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HAMD-17評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（表1）。

表1 3 組一般資料比較Tab 1 Comparison of general data among the three groups

2.2 血漿miRNA-16 及血小板SERT 蛋白表達(dá)水平

健康對照組miRNA-16 相對表達(dá)量為1.00±1.18，未服藥病例組為0.81±0.85，藥物治療組為1.08±1.78， 3 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.421，P=0.657）。健康對照組血小板SERT 蛋白的相對表達(dá)量為0.96±0.31，未服藥病例組為 0.93±0.35，藥物治療組為0.89±0.35，3 組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.112，P=0.894）。

2.3 隨訪研究結(jié)果

被隨訪患者與未被隨訪患者的性別、年齡、HAMD-17 評分、服藥前miRNA-16 相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

未 服 藥 病 例 組 男 性7 例， 女 性7 例， 平 均 年 齡（39.57±14.55）歲。未服藥病例組患者經(jīng)過2 個月治療，HAMD-17 評分從（21.43±3.37）分降至（10.07±6.91）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.187，P=0.001）；未服藥病例組14 例患者中， 7 例（50%）患者減分率大于50% 。患者服藥前后血小板 SERT蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.750，P=0.470）；經(jīng)過2 個月的（艾司）西酞普蘭治療，患者血漿miRNA-16 相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.455，P=0.032）（表2）。

表2 （艾司）西酞普蘭治療前后抑郁癥患者HAMD-17 評分及血漿miRNA-16 和血小板SERT 蛋白表達(dá)水平的比較（N=14）Tab 2 Comparison of HAMD-17 score, plasma miRNA-16 and platelet SERT levels before and after citalopram treatment for patients with depression (N=14)

3 討論

（艾司）西酞普蘭是一種選擇性較高的 SSRIs 類抗抑郁藥物，只對5-HT 系統(tǒng)產(chǎn)生影響，對其他神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)影響較小，故本研究僅選擇此藥進(jìn)行“5-HT 功能低下假說”相關(guān)通路探討。本研究分為2 個步驟：第一步以未服藥的抑郁癥患者和規(guī)律服用（艾司）西酞普蘭6 周及以上患者作為研究對象，探討（艾司）西酞普蘭對抑郁癥患者外周血miRNA-16 / SERT 通路相關(guān)指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示被試外周血miRNA-16 分布離散度很大，miRNA-16 及其下游調(diào)控蛋白SERT 在3 組中無明顯差異；第二步對在第一步中收錄的未服藥抑郁癥患者進(jìn)行了8 周隨訪，結(jié)果顯示在藥物治療后miRNA-16 的表達(dá)升高。（艾司）西酞普蘭藥物作用導(dǎo)致此結(jié)果的可能性很大，與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相似性。近年來多項(xiàng)對動物大腦的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-16 與SSRIs 類抗抑郁劑和SERT 的表達(dá)有密切關(guān)系。Baudry 等[3]系統(tǒng)論證了在小鼠大腦中miRNA-16 是SERT 轉(zhuǎn)錄后的阻抑物以及SSRIs類藥物的藥理學(xué)靶點(diǎn)，為miRNA 的研究提供新的思路。之后Launay 等[5]在小鼠、海馬中的研究也部分驗(yàn)證了此觀點(diǎn)。動物實(shí)驗(yàn)研究[6]發(fā)現(xiàn)，慢性SSRIs 刺激會提高小鼠大腦中縫核miRNA-16 水平、降低SERT 蛋白水平，在SSRIs 的療效中miRNA-16 起重要作用?？傮w上，目前的研究結(jié)果支持miRNA-16 廣泛參與大腦對SSRIs 的反應(yīng)，或者說正是SSRIs 導(dǎo)致的miRNA-16 的變化使抗抑郁劑產(chǎn)生了療效。

在本研究的病例對照研究部分，結(jié)果顯示與對照組相比，miRNA-16 在未服藥抑郁患者和（艾司）西酞普蘭治療患者血漿中均無變化，與后續(xù)隨訪結(jié)果不一致。這可能與外周血漿中miRNA-16 的來源有關(guān)，因 miRNA-16 非特異性地只在腦部表達(dá)[7]，血漿miRNA-16 水平可能會受到外周組織的干擾。一項(xiàng)研究[8]也顯示，未進(jìn)行藥物干預(yù)的抑郁癥患者血漿miRNA-16 水平未發(fā)生變化，但腦脊液中miRNA-16 水平顯著降低。

血小板內(nèi)的5-HT 來源于SERT 的攝入，過程與中樞5-HT 能神經(jīng)元類似。在中樞系統(tǒng)SERT 能夠清除突觸間隙5-HT，對5-HT 信號的強(qiáng)度和持續(xù)性進(jìn)行微調(diào)。既往對血小板5-HT 水平的研究結(jié)果比較一致，均觀察到服用SSRIs 后血小板5-HT 顯著降低，而引起這一改變的原因可能與SERT 有密切關(guān)系[5]。但是由于技術(shù)問題，在臨床實(shí)驗(yàn)中研究人類中樞 SERT 的結(jié)合情況和功能存在難度。迄今為止只有正電子成像術(shù)可以部分實(shí)現(xiàn)對患者中樞SERT 活性的觀察，但也有很大局限性，且在大部分5-HT神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中未發(fā)現(xiàn)合適配體[9]。但由于SERT 蛋白在血小板膜中廣泛存在，結(jié)構(gòu)和功能相似，故血小板膜SERT 可能是替代中樞腦組織可以選擇的外周模型。本研究進(jìn)一步用Western blotting 檢測了血小板SERT 蛋白水平，結(jié)果顯示，健康對照組、未服藥病例組和藥物治療組之間SERT蛋白的表達(dá)無明顯差異。針對5-HT 與血小板SERT 蛋白密度和表達(dá)量關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，結(jié)論不一致。對血小板功能的體內(nèi)研究報(bào)道，西酞普蘭同時(shí)降低了SERT 的功能和蛋白表達(dá)[10]。以高血壓患者為樣本的病例對照研究闡述了血漿5-HT 水平與血小板SERT 蛋白水平的關(guān)系，認(rèn)為外源性5-HT 可以改變血小板膜上SERT 分子密度以調(diào)控5-HT 的攝取率[11]。Little 等[12]將血小板從血漿中分離，離體狀態(tài)下用氟西汀處理并保持其活性，24 h 后檢測血小板SERT 免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)氟西汀處理組血小板SERT 免疫反應(yīng)性明顯降低。既往研究中也有不支持SERT 蛋白密度或表達(dá)量發(fā)生改變的結(jié)論。Ellis 等[13]對76 篇相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，認(rèn)為抑郁癥患者的血小板帕羅西汀結(jié)合率與對照組相比無顯著差異。關(guān)于SERT 功能降低的形式和原因，Qian 等[14]報(bào)道蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可通過參與SERT 的內(nèi)化，即SERT 從胞膜向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，實(shí)現(xiàn)其對SERT 的調(diào)控。除PKC 外，對SERT 蛋白的研究發(fā)現(xiàn)其存在多個蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。此后的研究證明蛋白激酶、蛋白磷酸酶、活性氧、一氧化氮等信號分子對SERT 有調(diào)控作用，彼此之間可能形成復(fù)雜的信息網(wǎng)絡(luò)相互作用、相互制約，以實(shí)現(xiàn)對 SERT 的精細(xì)調(diào)節(jié)[15]。

通過對血小板SERT 的定量檢測，本研究認(rèn)為在慢性（艾司）西酞普蘭刺激下，血小板5-HT 的減少并非是由血小板膜上SERT 蛋白量或蛋白密度降低這一簡單的變化引起，有可能與SERT 功能降低有關(guān)；而抑郁癥患者SERT功能降低的表現(xiàn)形式和原因，仍有待更深入的研究。由于miRNA-16 特異性調(diào)節(jié)SERT 蛋白的翻譯過程，miRNA-16在血漿中的穩(wěn)定性可以一定程度上成為血小板膜SERT 蛋白水平未發(fā)生改變的原因。

綜上，本研究在抑郁癥患者外周循環(huán)中觀察到SSRIs類藥物（艾司）西酞普蘭對血漿miRNA-16 的影響。另外，通過檢測SERT 蛋白水平，排除應(yīng)用SSRIs 后外周血小板5-HT 水平的降低由血小板膜SERT 蛋白水平降低引起的可能，提示對外周SERT 蛋白的焦點(diǎn)應(yīng)轉(zhuǎn)向蛋白功能，為進(jìn)一步研究提供了方向。本研究也存在以下局限性：①樣本量較小，隨訪研究中僅有14 例服用（艾司）西酞普蘭患者，雖然患者服藥后miRNA-16 變化的一致性較高，但研究結(jié)果的證實(shí)還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以及擴(kuò)充SSRIs 類藥物使用的種類加以證實(shí)。②僅對血小板SERT 蛋白進(jìn)行了定量檢測，未進(jìn)一步進(jìn)行蛋白功能如磷酸化、甲基化等檢測，尚無法明確解釋服用SSRIs 后血小板5-HT 減少原因。

參·考·文·獻(xiàn)

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