基因芯片篩選脂蛋白脂酶基因雜合敲除小鼠的差異表達(dá)基因 和通路

陳寧欣，韓亭亭，鄭 爽，劉 偉，胡耀敏

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200127

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人們生活水平的提高，罹患糖尿病的人群數(shù)量呈快速攀升的趨勢(shì)。2013 年全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)18 歲及以上人群的糖尿病及糖尿病前期的患病率分別為10.9%和35.7%[1]。糖尿病的發(fā)生可增加各類(lèi)慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，不僅會(huì)危害人們的生命健康，也給國(guó)家?guī)?lái)了較重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，闡明糖尿病的發(fā)病機(jī)制對(duì)于該疾病的預(yù)防和治療具有重大意義。目前，脂毒性在2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色。Banting 科學(xué)成就獎(jiǎng)獲得者M(jìn)cGarry 教授[2]提出，脂代謝障礙是T2DM的原發(fā)病理生理改變，T2DM 糖代謝紊亂的根源即為脂代謝異常，甚至還將T2DM 稱為“糖脂病”。流行病學(xué)研究調(diào)查結(jié)果顯示，高甘油三酯血癥（hypertriglyceridemia，HTG）是T2DM 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是催化乳糜微粒（chylomicron，CM）和極低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein，VLDL）中三酰甘油（triacylglycerol，TAG）水解的關(guān)鍵酶，其結(jié)構(gòu)和功能的異?？梢l(fā)HTG[4]。本課題組的前期研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，Lpl 基因敲除的雜合（Lpl+/-）小鼠可通過(guò)HTG 直接誘發(fā)糖代謝異常；隨后，進(jìn)一步研究[7]發(fā)現(xiàn)Lpl+/-小鼠出現(xiàn)了胰島脂滴沉積，經(jīng)胰島β 細(xì)胞葡萄糖刺激后，其胰島素分泌能力出現(xiàn)明顯下降。繼而推測(cè)，脂毒性可通過(guò)引起胰島β 細(xì)胞功能障礙來(lái)誘發(fā)糖代謝異常，但其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

基因芯片具有高通量及高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，能夠高效率地篩選正常組織和病理組織中差異表達(dá)的基因，有助于深入認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生的分子機(jī)制，以達(dá)到對(duì)疾病的早期診斷及干預(yù)。本研究通過(guò)基因芯片篩選Lpl+/-小鼠和野生型（wild type，WT）C57BL/6 小鼠的胰島組織中的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并利用生物信息學(xué)分析對(duì)這些基因進(jìn)行聚類(lèi)和功能富集分析，以期為尋找脂毒性介導(dǎo)T2DM 的發(fā)病過(guò)程中的新的分子機(jī)制提供參考和依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

40 周齡SPF 級(jí)雄性Lpl+/-小鼠及WT C57BL/6 小鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-2018]，體質(zhì)量為（25±5） g。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物房清潔級(jí)屏障系統(tǒng)中，使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2011-2021。小鼠飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。飼養(yǎng)條件如下：照明周期為12 h/12 h，溫度為21 ℃，濕度為50%～55%。所有動(dòng)物相關(guān)操作均遵循國(guó)家及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院有關(guān)動(dòng)物倫理規(guī)定及條例。

膠原酶Ⅴ（Sigma，美國(guó)），1640 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本），SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，日本）。

1.2 研究方法

1.2.1 胰島的分離及純化 麻醉后取小鼠仰臥位固定，顯微鏡下找到小鼠膽總管近肝門(mén)處，經(jīng)膽總管插管逆行注入0 ℃膠原酶Ⅴ消化液。待胰腺緩慢膨脹后，摘除整個(gè)胰腺，后經(jīng)膠原酶Ⅴ消化、密度梯度離心法分離胰島。于顯微鏡下手工挑選完整胰島，加入1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后更換培養(yǎng)基，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 微陣列芯片雜交與數(shù)據(jù)分析 微陣列芯片雜交實(shí)驗(yàn)委托上?；鬯闵锛夹g(shù)有限公司完成。使用STAR 軟件統(tǒng)計(jì)基因的原始序列計(jì)數(shù)，使用R 語(yǔ)言中DESeq2 篩選Lpl+/-小鼠及WT 小鼠胰島組織中DEGs?；虮磉_(dá)的差異用P 值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的對(duì)數(shù)（log2FC）表 示。將P＜0.05 且|log2FC|＞2 的 基 因 視 為DEGs。使用R 語(yǔ)言中的clusterProfiler 包對(duì)DEGs 進(jìn)行GO（Gene Ontology） 功 能 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome）通路分析，分析結(jié)果以P＜0.05 為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 RNA 抽提及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 將離體培養(yǎng)的胰島組織收集于離心管中，低速離心獲得沉淀。向其中加入磷酸鹽緩沖液漂洗后，立即加入總RNA 抽提試劑TRIzol，并依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA。而后，采用超微量分光光度計(jì)對(duì)RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定，分裝后凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）對(duì)DEGs 中與胰島β 細(xì)胞功能最密切相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將相關(guān)試劑與0.5 μg 總RNA 混合均勻（總體積為10 μL，加入RNA 體積根據(jù)濃度計(jì)算）進(jìn)行反應(yīng)，條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。而后使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，將1 μL cDNA 與相關(guān)試劑混合配置10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共20 個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）為內(nèi)參，基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次分析（即設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔）。Gremlin 1（Grem1）、骨形態(tài)形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，Bmp-2）、Bmp-4 及Gapdh 引物均由上海冠泰生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

Continued Tab

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。qPCR 數(shù)據(jù)用±s 表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選DEGs

本研究采用R 語(yǔ)言中DESeq2 對(duì)Lpl+/-小鼠及WT 小鼠胰島組織中的DEGs 進(jìn)行篩選，并采用火山圖和聚類(lèi)熱圖進(jìn)行分析。結(jié)果顯示共篩選出187 個(gè)DEGs，上調(diào)基因6 個(gè)、下調(diào)基因181 個(gè)（圖1、2）；其中，表達(dá)差異最為顯著的前10 個(gè)基因見(jiàn)表2。

圖1 Lpl+/-小鼠與WT 小鼠DEGs 的火山圖分析Fig 1 Volcano plot of DEGs between Lpl+/- mice and WT mice

圖2 Lpl+/-小鼠與WT 小鼠DEGs 的聚類(lèi)熱圖Fig 2 Heat map of DEGs between Lpl+/- mice and WT mice

表2 DEGs 中排名前10 的基因列表Tab 2 Top 10 genes of DEGs

2.2 GO 功能分析

本研究采用R 語(yǔ)言中的clusterProfiler 包進(jìn)行GO 功能分析，以P＜0.05 進(jìn)行篩選，結(jié)果（圖3）顯示DEGs主要富集在與T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞激活和侵襲以及細(xì)胞黏附相關(guān)的生物過(guò)程，同時(shí)與細(xì)胞質(zhì)膜蛋白等細(xì)胞組成和細(xì)胞因子受體活性調(diào)節(jié)等生物功能密切相關(guān)。

圖3 DEGs 的GO 功能分析Fig 3 GO function analysis of DEGs

2.3 KEGG 通路分析

隨后，本研究使用KEGG 對(duì)DEGs 進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果（圖4）顯示這些基因主要富集在免疫細(xì)胞增殖分化、炎癥信號(hào)通路、血管形成和細(xì)胞黏附相關(guān)通路上，且與Lpl+/-小鼠的胰島β 細(xì)胞功能障礙相關(guān)。

圖4 DEGs 的KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of DEGs

2.4 關(guān)鍵基因的表達(dá)驗(yàn)證

在上述羅列的前10 個(gè)DEGs 中，Grem1 編碼的蛋白gremlin 1 為BMP 拮抗劑家族的成員[8]，該蛋白可通過(guò)與BMP-2、BMP-4 蛋白的直接結(jié)合阻斷BMP 作用的信號(hào)通路。研究[9]發(fā)現(xiàn)，BMP 可參與胚胎期胰腺生長(zhǎng)、增殖及分化的調(diào)節(jié)，與胰島β 細(xì)胞功能有密切關(guān)系。基于此，本研究選擇Grem1 進(jìn)行驗(yàn)證；結(jié)果（圖5）顯示，與WT小鼠相比，Lpl+/-小鼠胰島組織中Grem1 的表達(dá)量下降了75%，而B(niǎo)mp-2 及Bmp-4 的表達(dá)量則增加了1 倍甚至 更多。

圖5 qPCR 檢測(cè)WT 小鼠和Lpl+/-小鼠胰島組織中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平Fig 5 Expression levels of key genes in the islet tissues of WT mice and Lpl+/- mice

3 討論

胰島β 細(xì)胞功能異常是導(dǎo)致T2DM 的核心病理生理基礎(chǔ)之一，同時(shí)脂代謝紊亂在其發(fā)病過(guò)程中亦發(fā)揮著重要作用。脂毒性是指血中的游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平長(zhǎng)期較高，而超過(guò)了脂肪組織的儲(chǔ)存能力及各組織對(duì)FFA 的氧化能力，使得過(guò)多的FFA 以TAG 的形式沉積在非脂肪組織，從而造成對(duì)該組織的損傷[2]。FFA 的長(zhǎng)期作用可誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡、引起β 細(xì)胞壞死，以減少β 細(xì)胞數(shù)目。研究[6]發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)HTG 的Lpl+/-小鼠的脂代謝障礙在發(fā)生時(shí)間的順序上優(yōu)先于糖代謝紊亂，可以很好地模擬HTG 引發(fā)T2DM 的病理生理過(guò)程。本課題組的前期研究[7]表明，Lpl+/-小鼠出現(xiàn)胰島脂滴沉積、胰島β 細(xì)胞團(tuán)體積減小同時(shí)細(xì)胞凋亡增加，Lpl+/-小鼠胰島細(xì)胞經(jīng)葡萄糖刺激后胰島素的分泌能力明顯下降，而這些結(jié)果亦在體外高脂模型（棕櫚酸刺激的胰島β 細(xì)胞）中得到了進(jìn)一步證實(shí)。為了探討可能的分子機(jī)制，本研究將Lpl+/-小鼠及WT 小鼠的胰島進(jìn)行分離并純化，利用基因芯片篩選小鼠胰島中的DEGs，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)這些基因進(jìn)行聚類(lèi)分析和功能富集，選擇關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。

在表達(dá)差異最為顯著的前10 個(gè)基因中，Ighe、Ighg1、Ighg2b、Igkv9-120 是免疫反應(yīng)中抗原結(jié)合、免疫球蛋白產(chǎn)生及免疫球蛋白受體結(jié)合相關(guān)的分子；Ifi202b 參與黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎癥體激活的負(fù)向調(diào)控，且有研究[10]表明該基因還參與了小鼠脂肪干細(xì)胞的脂肪生成；有研究者發(fā)現(xiàn)，Ubd 在老化和慢性疾病中具有免疫代謝調(diào)節(jié)作用，還可介導(dǎo)慢性腎臟疾病中核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活從而促進(jìn)腎小管間質(zhì)炎癥的發(fā)生與發(fā)展[11-12]；Mmp12 與動(dòng)脈硬化相關(guān)，還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平來(lái)調(diào)節(jié)小鼠的炎癥反應(yīng)[13]；Cxcl9 在皮炎的小鼠模型中表達(dá)顯著升高，且與炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)，同時(shí)也參與了某些自身免疫疾病的發(fā)生[14]；Gimap3 可與核酸及GTP 相結(jié)合，與T 細(xì)胞發(fā)生和存活相關(guān)。針對(duì)以上基因，目前暫無(wú)相關(guān)證據(jù)表明其與胰島β 細(xì)胞功能或T2DM 存在相關(guān)性。但值得注意的是，Grem1 編碼合成的gremlin 1 屬于BMP 拮抗劑家族的重要成員，可阻斷下游BMP 信號(hào)通路。BMP 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的一員，包括大量保守結(jié)構(gòu)區(qū)域的分泌信號(hào)分子，可在控制胚胎發(fā)育及分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還參與胚胎期胰腺生長(zhǎng)、增殖及分化的調(diào)節(jié)[9]。有研究[15]表明，促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）可能通過(guò)激活BMP-2 誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞的凋亡及功能障礙。而B(niǎo)MP-2 和BMP-4 的表達(dá)則能夠?qū)σ葝uβ 細(xì)胞的增殖及分泌功能產(chǎn)生抑制作用[16]。Sakhneny 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胰島β 細(xì)胞可表達(dá)BMP-4 的受體，且BMP-4 與β 細(xì)胞功能相關(guān)。上述研究均提示，BMP 信號(hào)通路可能在糖尿病胰島功能異常中扮演著重要角色。因此，本研究利用qPCR 對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Lpl+/-小鼠胰島組織中Grem1 的表達(dá)量較WT 小鼠顯著下降，而B(niǎo)mp-2 及Bmp-4 的表達(dá)量則明顯增加；繼而推測(cè)，gremlin 1 及其下游BMPs 信號(hào)通路可能參與了由脂毒性介導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞功能障礙的發(fā)生及發(fā)展。此外，還有研究[18-19]表明Grem1 可能與T2DM 患者的蛋白尿及糖尿病腎病的發(fā)生相關(guān)。

通過(guò)對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)DEGs 參與了免疫細(xì)胞增殖分化、炎癥信號(hào)通路、血管形成和細(xì)胞黏附相關(guān)通路。已經(jīng)有研究[20]證實(shí)了脂毒性誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在胰島功能障礙中的作用，即在高脂喂養(yǎng)的小鼠中，胰島組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加；還有研究[21]發(fā)現(xiàn)胰島β 細(xì)胞內(nèi)的脂肪細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子及趨化因子，通過(guò)激活炎癥信號(hào)通路導(dǎo)致β 細(xì)胞功能障礙。本課題組最新的研究[7]結(jié)果也證實(shí)，在Lpl+/-小鼠血清中和棕櫚酸刺激的胰島β 細(xì)胞上清液中，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 及巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）的水平明顯上升，Lpl+/-小鼠胰島組織上清液中MIF 的表達(dá)也顯著增加，同時(shí)Lpl+/-小鼠胰島組織和棕櫚酸刺激的胰島β 細(xì)胞中NF-κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factor-κB，IκB） /NF-κB 炎 癥 信 號(hào)通路被激活，且與β 細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。而另有研究[22]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA 可招募外周循環(huán)中的炎癥型單核細(xì)胞至胰島組織中并轉(zhuǎn)化為M1 型巨噬細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島組織中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能 障礙。

本研究GO 功能分析還發(fā)現(xiàn)，DEGs 主要富集在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞激活的生物過(guò)程，同時(shí)亦有越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注自身免疫在糖尿病發(fā)病過(guò)程中的作用。自身免疫是一種多因素參與的對(duì)自身構(gòu)成成分產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過(guò)程，主要特點(diǎn)是自身耐受的缺失以及B 細(xì)胞和T細(xì)胞慢性的過(guò)度反應(yīng)。研究[23]顯示，T2DM 患者胰島中的促炎細(xì)胞因子被激活，可引發(fā)免疫反應(yīng)導(dǎo)致胰島功能異常，這種由炎癥導(dǎo)致的組織損傷會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)自身免疫反應(yīng)，從而形成惡性循環(huán)；且在T2DM 患者的胰島中可觀察到免疫細(xì)胞的交替和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外，M1 型巨噬細(xì)胞可分泌大量的促炎因子包括IL-12、TNF-α、IL-1、IL-6 等以及趨化因子以參與炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能障礙的發(fā)生。而B(niǎo) 細(xì)胞與T 細(xì)胞的直接作用對(duì)胰島β 細(xì)胞功能的影響尚缺乏相關(guān)證據(jù)。因此，更加深入地探索自身免疫在T2DM 發(fā)生與發(fā)展中的作用和相關(guān)機(jī)制，或?qū)⒂兄谠谂R床上對(duì)糖尿病的分型和治療提供參考。

綜上所述，本研究通過(guò)基因芯片篩選WT 小鼠及Lpl+/-小鼠的DEGs，并針對(duì)這些基因開(kāi)展相關(guān)功能及通路分析，發(fā)現(xiàn)DEGs 主要富集于自身免疫和炎癥信號(hào)通路，同時(shí)脂毒性導(dǎo)致的Grem1 表達(dá)下調(diào)可能與胰島β 細(xì)胞功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)。該結(jié)果或?qū)檫M(jìn)一步理解和認(rèn)識(shí)脂毒性導(dǎo)致T2DM 的發(fā)病機(jī)制提供參考，同時(shí)也將為后續(xù)的T2DM 病因研究提供新的方向。

參·考·文·獻(xiàn)

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