OX40/FcγR 多基因人源化小鼠模型的構(gòu)建及在激動(dòng)型OX40抗體研究中應(yīng)用的驗(yàn)證

劉明東，劉小波，趙英杰，張 燕，張慧慧，李福彬

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海市免疫學(xué)研究所，上海200025

單克隆抗體免疫治療是一種新興且十分有效的腫瘤治療方法。以抗細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 -4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）抗體和程序性死亡受體 -1（programmed death-1，PD-1）抗體為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制型抗體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床，James P. Allison 和Tasuku Honjo 作為主要貢獻(xiàn)者被授予2018 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。然而，免疫檢查點(diǎn)抑制型抗體在臨床治療中存在部分患者無(wú)效以及出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)等問(wèn)題[1-2]，亟需進(jìn)一步研發(fā)其他治療手段。作用于免疫共刺激分子，如腫瘤壞死因子受體超家族成員5（tumor necrosis factor receptor superfamily member 5，CD40）、 腫 瘤 壞死因子受體超家族成員4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，OX40）的激動(dòng)型抗體被認(rèn)為是一類(lèi)具有廣泛潛力的抗體，它們能夠激活免疫檢查點(diǎn)的細(xì)胞信號(hào)通路[3-4]，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞增加免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性，發(fā)揮抗腫瘤作用。但是目前激動(dòng)型抗體尚未被成功應(yīng)用于臨床，需要進(jìn)一步研發(fā)。為此，構(gòu)建能夠有效評(píng)估抗體活性的動(dòng)物模型成為關(guān)鍵。

OX40 是一類(lèi)表達(dá)在T 細(xì)胞上的共刺激分子[5-6]，屬于腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）。激活T 細(xì)胞上的OX40 能夠明顯促進(jìn)T 細(xì)胞增殖，提高T 細(xì)胞的反應(yīng)活性[7-10]。2000 年，Weinberg 等[11]首次在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了抗OX40 抗體的抗腫瘤作用。雖然目前已經(jīng)有數(shù)種抗OX40 抗體藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段[12]，但抗OX40 抗體的抗腫瘤機(jī)制并未被完全闡明。一般認(rèn)為，抗OX40 抗體可直接激活效應(yīng)T 細(xì)胞的OX40 信號(hào)通路，提高免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[11]。近年來(lái)有研究[13]表明，抗OX40 抗體分子可以通過(guò)結(jié)合活化型Fcγ 受體（Fcγ receptor，F(xiàn)cγR）來(lái)清除腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)OX40 的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg 細(xì)胞），解除Treg 細(xì)胞對(duì)于免疫應(yīng)答的抑制。也有學(xué)者認(rèn)為，作用于TNFRSF 成員的抗體可能會(huì)通過(guò)抑制型FcγR 來(lái)激活靶點(diǎn)分子的信號(hào)通路[13-14]。因此，一個(gè)適合抗人OX40 抗體實(shí)驗(yàn)的小鼠模型除了要表達(dá)人源化的OX40分子，應(yīng)該同時(shí)表達(dá)人源化的FcγR。

目前，用于研究適用于人類(lèi)靶點(diǎn)分子的人類(lèi)激動(dòng)型抗體的小鼠模型主要有靶點(diǎn)分子人源化小鼠、人源化小鼠（接受了人類(lèi)免疫細(xì)胞移植的免疫缺陷小鼠）、靶點(diǎn)分子和FcγR 人源化的小鼠，這幾種模型具有不同的特點(diǎn)。靶點(diǎn)分子人源化小鼠由于只是將靶點(diǎn)分子進(jìn)行了人源化，獲取相對(duì)簡(jiǎn)單，但是因?yàn)樾∈篌w內(nèi)沒(méi)有人源化的FcγR，所以靶點(diǎn)分子人源化小鼠并不能為人類(lèi)激動(dòng)型抗體發(fā)揮作用提供完整的環(huán)境。人源化小鼠體內(nèi)存在人類(lèi)的免疫細(xì)胞，理論上可以滿(mǎn)足人類(lèi)激動(dòng)型抗體的作用條件，但是受體小鼠本身存在免疫缺陷，并且人類(lèi)免疫細(xì)胞和小鼠免疫細(xì)胞生存和發(fā)育條件有很大的差異性，所以不能保證人類(lèi)免疫細(xì)胞在小鼠體內(nèi)正常發(fā)生免疫應(yīng)答[15]。只有當(dāng)與抗體直接結(jié)合的靶點(diǎn)分子OX40 和FcγR 人源化了，抗體的工作環(huán)境才更接近人體環(huán)境，因此構(gòu)建OX40/FcγR 多基因人源化小鼠模型研究抗人OX40 抗體很有必要。OX40/FcγR 多基因人源化小鼠不但可以為人類(lèi)激動(dòng)型抗體提供完整的結(jié)合位點(diǎn)，并且擁有健全的免疫系統(tǒng)[16]，是目前研究人類(lèi)激動(dòng)型抗體最為理想的模型。但是由于FcγR 人源化涉及的基因較多，基因型為Fcgrα-/-/Fcgr1-/-/hFCGR1+/hFCGR2A131R+/hFCGR2B+/hFCGR3A158F+/hFCGR3B+[16][Fcgrα 為編碼小鼠Fcγ 受體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的α 鏈的基因，F(xiàn)cgr1 為編碼小鼠Fcγ 受體Ⅰ的α 鏈的基因；hFCGR1、hFCGR2A131R、hFCGR2B、hFCGR3A158F、hFCGR3B 分別為編碼人類(lèi)Fcγ 受體Ⅰ、ⅡA（131R）、ⅡB、ⅢA（158F）、ⅢB 的α 鏈的基因]，使得這種小鼠難以通過(guò)常規(guī)的雜交繁殖法快速構(gòu)建。為了能夠快速獲得OX40/FcγR多基因人源化小鼠，本研究初步驗(yàn)證了骨髓嵌合法的可行性。通過(guò)骨髓細(xì)胞嵌合法建立的OX40/FcγR 多基因人源化小鼠模型擁有相對(duì)正常的免疫系統(tǒng)，可同時(shí)提供人源FcγR 和人源OX40 分子，并且模型小鼠制作過(guò)程簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，可以較好地滿(mǎn)足人類(lèi)激動(dòng)型抗人OX40 抗體的腫瘤治療研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

C57BL/6 野生型小鼠，雌性，8 ～10 周齡，體質(zhì)量20 ～25 g，購(gòu)自上海靈暢生物技術(shù)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0003；mFcγR-/-hFcγRtg轉(zhuǎn) 基 因 小 鼠（Fcgrα-/-/Fcgr1-/-/hFCGR1+/hFCGR2A131R+/hFCGR2B+/hFCGR3A158F+/hFCGR3B+） 由 美 國(guó)Rockefeller大學(xué)Jeffrey V. Ravetch 教授惠贈(zèng)；hOX40tg轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2014-0002。以上小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF 級(jí)動(dòng)物房，使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2018-0027。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作均獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì) 批準(zhǔn)。

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用的抗體信息見(jiàn)表1。人類(lèi)抗人OX40 抗體A、人類(lèi)抗人OX40 抗體B、DEC-OVA 蛋白［抗DEC205 抗體和卵清蛋白（OVA）的融合蛋白，用于提呈OVA 抗原］均購(gòu)自信達(dá)生物制藥有限公司。紅細(xì)胞裂解液、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Brefeldin A 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，人IgG 同型對(duì)照抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司，青鏈霉素購(gòu)自北京四季青生物科技有限責(zé)任公司，SIINFEKL 抗原肽購(gòu)自美國(guó)BioLegend 公司，抗CD28 抗體、抗CD3 抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

表1 流式抗體列表Tab 1 List of antibodies for flow cytometry

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨髓嵌合小鼠的制備方法 取8～24周齡的mFcγR-/-hFcγRtg轉(zhuǎn)基因小鼠或者h(yuǎn)OX40tg轉(zhuǎn)基因小鼠。處死后，取小鼠股骨、脛骨。用剪刀去除骨的兩端。用1 mL 注射器吸取無(wú)菌PBS 緩沖液，反復(fù)沖洗骨髓腔中的骨髓至六孔板中。用孔徑70 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾骨髓細(xì)胞懸液，將骨髓細(xì)胞懸液移至15 mL 離心管中400×g 離心5 min。棄去上清液，向離心管中加入4 mL 紅細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解紅細(xì)胞。5 min 后，向離心管中加入10 mL PBS 終止反應(yīng)。離心管400×g 離心5 min 后，棄上清液，重復(fù)操作 2 遍。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)到1×107/mL。 然后將2 種小鼠的骨髓懸液按照1:1 的比例混合。把混合好的骨髓細(xì)胞懸液經(jīng)尾靜脈注射到經(jīng)過(guò)8 Gy 輻照的8 周齡的C57BL/6 野生型小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射200 μL 骨髓細(xì)胞懸液。小鼠正常飲食，飲用水中含有1×青鏈霉素，2 個(gè)月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 外周血和脾臟淋巴細(xì)胞的采集及處理 通過(guò)眼眶采集外周血約100 μL，加入肝素抗凝。處死小鼠，取小鼠右側(cè)腹股溝淋巴結(jié)、脾臟。取下的淋巴結(jié)、脾臟經(jīng)孔徑70 μm 的細(xì)胞濾網(wǎng)研磨，在研磨液中加入 1×PBS 溶液制成細(xì)胞懸液。外周血和脾細(xì)胞懸液采集后均需要使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。①hCD32 的檢測(cè)：獲取的外周血、脾細(xì)胞懸液、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液使用流式抗體染色。所有抗體均稀釋400 倍使用，染色后的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。②γ-干擾素（interferon γ，IFN-γ）的流式檢測(cè)：將制備好的脾細(xì)胞懸液200 μL 置于96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)。向 每 孔 加 入1 μg/mL 抗CD28 抗 體、1 μg/mL SIINFEKL 抗原肽。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育1 h 后每孔細(xì)胞中加入10 μg/mL 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Brefeldin A。繼續(xù)孵育5 h 后根據(jù)流式抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。③人源OX40分子表達(dá)的流式檢測(cè)：將制備好的外周血、淋巴細(xì)胞懸液、脾細(xì)胞懸液置于96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)。用 含 有2 μg/mL 的 抗CD28 抗 體、2 μg/mL 抗CD3 抗 體的培養(yǎng)基200 μL 重懸細(xì)胞。將96 孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育。48 h 后使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)人源OX40 分子時(shí)，使用抗體A 作為一抗，再使用BV421標(biāo)記的抗hIgG-Fc 流式抗體進(jìn)行染色。同時(shí)使用人類(lèi)抗人CD40 抗體作為同型對(duì)照。

1.2.3 小鼠體內(nèi)的抗體活性檢測(cè) 第1 日，將人類(lèi)抗人OX40 抗體B 和人IgG 同型對(duì)照抗體分別與DEC-OVA 蛋白混合，并通過(guò)小鼠腹腔（3 只/組）進(jìn)行注射。其中抗體劑量為每只小鼠250 μg，DEC-OVA 蛋白為每只小鼠5 μg。7 d 后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+和CD8+T 細(xì)胞的IFN-γ 表達(dá)水平以及CD4+T 細(xì)胞上的人源OX40 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料以±s 表示。2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓嵌合小鼠中hCD32 的檢測(cè)

分別將野生型小鼠組（n=3）和骨髓嵌合小鼠組（n=3）的外周血、脾臟及淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，以檢測(cè)骨髓嵌合小鼠中人源FcγR 的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)選取人類(lèi)FcγR 成員中的FcγR Ⅱ A 和FcγR Ⅱ B（統(tǒng)稱(chēng)hCD32）為代表進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示，在骨髓嵌合小鼠的外周血、脾臟和淋巴結(jié)中，有較高比例的髓系細(xì)胞（圖1A）和B 淋巴細(xì)胞（圖1B）表達(dá)hCD32。髓系細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞分別以CD11b 陽(yáng)性和B220 陽(yáng)性的免疫細(xì)胞表示。這一結(jié)果說(shuō)明，骨髓嵌合小鼠可以正常表達(dá)人源FcγR 分子。

圖1 骨髓嵌合小鼠體內(nèi)表達(dá)人源FcγR 的檢測(cè)Fig 1 Detection of hFcγR expression in bone marrow chimera mice

2.2 骨髓嵌合小鼠中人源OX40 的檢測(cè)

使用含抗CD3 抗體、抗CD28 抗體的培養(yǎng)基對(duì)野生型小鼠（n=3）和骨髓嵌合小鼠（n=3）的脾細(xì)胞進(jìn)行刺激培養(yǎng)。2 d 后，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)脾細(xì)胞中CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞表面的人源OX40 分子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，抗體刺激后的脾細(xì)胞中有將近50%的CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞表達(dá)人源OX40 分子（圖2）。

圖2 骨髓嵌合小鼠體內(nèi)人源OX40 的檢測(cè)Fig 2 Detection of hOX40 expression in bone marrow chimera mice

2.3 檢測(cè)人類(lèi)抗人OX40 抗體對(duì)CD4+ T 細(xì)胞活性的促進(jìn)作用

抗體B 為人類(lèi)抗人OX40 抗體。第1 日，將抗體與DEC-OVA 蛋白的混合液對(duì)小鼠（n=3）進(jìn)行腹腔注射。7 d 后，檢測(cè)CD4+T 細(xì)胞的IFN-γ 和人源OX40 分子的表達(dá)水平，兩者均出現(xiàn)了明顯升高，表明人類(lèi)抗人OX40 抗體對(duì)CD4+T 細(xì)胞有明顯的激活能力（圖3）。

圖3 骨髓嵌合小鼠CD4+ T 淋巴細(xì)胞活性檢測(cè)Fig 3 Detection of activity of CD4+ T lymphocyte in bone marrow chimera mice

2.4 檢測(cè)人類(lèi)抗人OX40 抗體對(duì)CD8+ T 細(xì)胞活性的促進(jìn)作用

第1 日，將抗體B 與DEC-OVA 蛋白的混合液對(duì)小鼠（n=3）進(jìn)行腹腔注射。7 d 后，通過(guò)檢測(cè)CD8+T 細(xì)胞的IFN-γ 表達(dá)水平分析人類(lèi)抗人OX40 抗體對(duì)CD8+T 細(xì)胞的激活水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗體B 對(duì)骨髓嵌合小鼠CD8+T細(xì)胞具有明顯的激活能力（圖4）。

圖4 骨髓嵌合小鼠CD8+ T 細(xì)胞活性檢測(cè)Fig 4 Detection of activity of CD8+ T in bone marrow chimera mice

3 討論

抗OX40 抗體的腫瘤治療效果已經(jīng)在臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證[17-18]。為了繼續(xù)對(duì)抗OX40 抗體的腫瘤治療機(jī)制進(jìn)行研究和進(jìn)一步優(yōu)化抗體的治療效果，迫切需要建立一個(gè)擁有健全免疫系統(tǒng)并且表達(dá)有人源FcγR 和人源OX40 分子的小鼠模型。結(jié)合現(xiàn)有條件，本研究組獲得這種小鼠模型有2 種方法：一種是通過(guò)OX40 人源化小鼠與FcγR 人源化小鼠的不斷回交獲得；另一種是通過(guò)將骨髓嵌合的方法獲得，即將人源OX40 分子和人源FcγR的小鼠的骨髓細(xì)胞按照1:1 的比例混合，然后通過(guò)尾靜脈將骨髓細(xì)胞混合液注射到輻照過(guò)的野生型小鼠體內(nèi)，形成嵌合小鼠。

通過(guò)對(duì)比2 種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)與雜交繁殖法相比，骨髓嵌合法可以在短時(shí)間內(nèi)滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求，并且組內(nèi)差異更小。這是因?yàn)榛蛐图兒闲∈蟮姆敝陈瘦^低，很難在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)用小鼠，并且人源化FcγR 小鼠涉及的基因較多，需要較長(zhǎng)的繁殖時(shí)間才可以獲得基因型純合小鼠。而作為骨髓嵌合受體的野生型小鼠可以直接從公司大量訂購(gòu)，能夠節(jié)省大量時(shí)間。同時(shí)，同一批次的小鼠年齡、性別、生理狀態(tài)非常接近，可以在一定程度上降低無(wú)關(guān)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。雖然骨髓嵌合法的一些實(shí)驗(yàn)操作要求較高，比如尾靜脈注射，但是如果加上實(shí)驗(yàn)操作練習(xí)的時(shí)間，骨髓嵌合法仍然要比雜交繁殖法高效。此外，已有研究[3]證明這種依賴(lài)于FcγR 的抗腫瘤效應(yīng)為順式作用，即需要通過(guò)OX40 分子和FcγR 分子分別表達(dá)在不同的細(xì)胞上。因此，骨髓嵌合小鼠中人源OX40 分子和FcγR 分子在2 種細(xì)胞上的分別表達(dá)并不會(huì)影響抗體依賴(lài)FcγR 發(fā)揮作用。

因?yàn)楣撬枨逗戏ň哂幸欢◤?fù)雜性，所以我們對(duì)模型是否建立成功進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。我們首先確認(rèn)了供體小鼠的人源化分子表達(dá)情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓嵌合小鼠脾臟、外周血和淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)約50%的B 淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞表達(dá)人源hCD32。這一結(jié)果表明骨髓嵌合小鼠可以正常表達(dá)人源FcγR；同時(shí)，骨髓嵌合小鼠的脾臟細(xì)胞在經(jīng)過(guò)抗CD3 和抗CD28 抗體激活后，CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞表面會(huì)表達(dá)高水平的人源化OX40 分子。最后，我們使用了人類(lèi)抗人OX40 抗體對(duì)骨髓嵌合小鼠進(jìn)行了檢測(cè)?？贵wB 在骨髓嵌合小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出了對(duì)CD8+T 細(xì)胞較強(qiáng)的激活能力。這說(shuō)明骨髓嵌合小鼠擁有較為完整的免疫系統(tǒng)，可以為人類(lèi)抗人OX40 抗體發(fā)揮作用提供條件。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種可以模擬人類(lèi)抗人OX40 抗體的人體作用環(huán)境的OX40/FcγR 多基因人源化小鼠模型。通過(guò)骨髓嵌合法獲得的小鼠不僅可以同時(shí)表達(dá)人源化的OX40 分子和FcγR 分子，擁有類(lèi)似于人體的抗體作用環(huán)境，而且個(gè)體之間在性別、年齡和人類(lèi)FcγR 基因型（來(lái)自相同的骨髓細(xì)胞）方面的差異較雜交繁殖法小，且耗時(shí)短，為探究不同人類(lèi)抗人OX40 抗體的作用機(jī)制，篩選高效的抗體提供了條件。同時(shí)，對(duì)于同種類(lèi)型的其他抗體，如抗CTLA-4 抗體、抗4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9，tumor necrosis factor receptor superfamily member 9）抗體和抗PD-1 抗體，本方法也有應(yīng)用潛力。今后，對(duì)構(gòu)建其他多基因人源化小鼠的有效性，以及骨髓嵌合小鼠與雜交繁殖策略產(chǎn)生的小鼠之間的差異性將做進(jìn)一步研究。

參·考·文·獻(xiàn)

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