響應(yīng)面優(yōu)化乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽的制備

劉 帆，吳戈儀，吳繼紅，王 琴

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510000；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

柚子核作為金柚產(chǎn)業(yè)的大宗加工副產(chǎn)物，資源豐富，但在金柚的加工和食用過(guò)程中，往往被忽視而遺棄，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。謝貞建等人[1]研究柚子核的化學(xué)組成為粗脂肪占柚子核的40.12%±0.13%，粗蛋白占32.89%±0.82%，含水量為12.08%±0.02%，總糖占11.22%±0.96%，灰分占5.35%±0.09%，且其中含有多種對(duì)人體健康有益的生理活性成分，如活性多糖、活性多肽、膳食纖維、黃酮等。因此，提高柚子核的高值化利用將會(huì)有效推動(dòng)金柚產(chǎn)業(yè)向資源節(jié)約型、環(huán)境友好型的轉(zhuǎn)型和發(fā)展。

關(guān)于金柚柚子核的研究剛剛起步，僅有關(guān)于其中的黃酮和檸檬苦素的優(yōu)化提取，以及柚子核中揮發(fā)油的化學(xué)成分等研究。其中，黃師榮等人[2]利用乙醇作為提取劑，在進(jìn)行提取工藝優(yōu)化后，柚子核中黃酮類化合物的提取率為0.968%。邵金華等人[3]以乙醇作為提取劑，在進(jìn)行提取工藝優(yōu)化后，柚子核中的檸檬苦素的提取率為3.967 mg/g。葉茂等人[4]利用超聲波輔助水酶法提取柚子核油，在進(jìn)行提取工藝優(yōu)化后，柚子籽油得率達(dá)到33.2%，且抗氧化性優(yōu)于維C和白藜蘆醇，這是由于柚子籽油中富含類黃酮、檸檬苦素等有效抗氧化成分。然而，有關(guān)柚子核中活性多肽的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

多肽是具有與其功能性蛋白質(zhì)相同序列的特異性小的無(wú)活性蛋白質(zhì)片段。通常，肽包含2～20個(gè)氨基酸[5]。與蛋白質(zhì)相比，生物活性肽的分子量較低、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、抗原較弱、毒副作用較低且易被人體吸收，具有較強(qiáng)的生理活性，包括調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗病毒及抗菌等，是當(dāng)今研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[6]。

由于乳酸菌的食物來(lái)源主要是纖維、乳糖、淀粉、寡糖，多肽幾乎不被利用，而其代謝產(chǎn)物中富含蛋白酶，可對(duì)天然產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，產(chǎn)生不同分子量的生物活性肽，利用這一特點(diǎn)選用微生物發(fā)酵法制備活性多肽，不僅成本較低并且在微生物發(fā)酵過(guò)程中其代謝等生理活動(dòng)可減少天然產(chǎn)物中的某些致敏成分，提高營(yíng)養(yǎng)成分含量[7]。

柚果加工，尤其是有關(guān)柚核、果皮等的綜合利用已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外科技工作者的關(guān)注。因此，利用響應(yīng)面優(yōu)化乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中活性多肽的提取，將為進(jìn)一步研究乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽的生理活性奠定基礎(chǔ)，有助于提高金柚加工過(guò)程中副產(chǎn)物的高值化利用，促進(jìn)金柚產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型與升級(jí)，未來(lái)勢(shì)必將加大對(duì)金柚加工副產(chǎn)物柚子核的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

柚子核，來(lái)源于廣東梅州的金柚柚子果實(shí)；乳酸菌（Lactobacillus amylolyticus 6），仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品，Meilunbio公司提供；MRS肉湯培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供；氯化鈉（AR）、三氯乙酸（AR）、碳酸鈉（AR）、氫氧化鈉（AR）、酒石酸鉀鈉（AR）、五水硫酸銅（AR），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；瓊脂、福林酚試劑，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 主要儀器

MGC-350H型恒溫培養(yǎng)箱，鄭州生元儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-50SII型高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；DHG-9023A型鼓風(fēng)干燥箱，飛迪科技有限公司產(chǎn)品；SCIENTZ-50F型真空冷凍干燥機(jī)，新芝凍干有限公司產(chǎn)品；SC-3610型離心機(jī)，中佳有限公司產(chǎn)品；ME203E型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；TU-1900型雙光束紫外可見(jiàn)分光度計(jì)，普析有限公司產(chǎn)品；HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市金壇大地自動(dòng)化儀器廠產(chǎn)品；RWD-1型超純水機(jī)，Heal Force有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 柚子核樣品制備

使用鼓風(fēng)干燥機(jī)于60℃下將金柚柚子核烘干至恒質(zhì)量，得干燥的柚子核。用組織搗碎機(jī)粉碎成粉末狀，并通過(guò)30目篩，得試驗(yàn)用柚子核粉末，保存于常溫干燥皿中，備用。

1.4.2 乳酸菌菌懸液制備

選定Lactobacillus amylolyticus 6作為微生物固態(tài)發(fā)酵菌種[8]。將MRS肉湯培養(yǎng)基以54 g/L的質(zhì)量濃度配置，并用滅菌鍋殺菌（121℃，15 min） 以備用。

將保存在-40℃的菌株復(fù)蘇，再將50 μL已融化的冷凍菌滴入25 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，用封口條封好，避免污染，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。將培養(yǎng)后的乳酸菌用20 mL無(wú)菌生理鹽水清洗并離心（1 200 r/min，15 min，常溫） 2次，每次倒掉上清液，以去除培養(yǎng)基，加入20 mL無(wú)菌0.9%NaCl鹽水，制備成懸濁液待用。

1.4.3 乳酸菌與柚子核的共生發(fā)酵

將已處理的柚子核粉末精密稱取1 g于錐形瓶中，用一定料液比的超純水將其浸濕，用封口條封好以免污染，于121℃下滅菌20 min后，在超凈工作臺(tái)上以一定百分比的接種量將乳桿菌接種于柚子核粉末表面，并置于一定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，發(fā)酵完成后立即將樣品放置在60℃烘箱中干燥48 h，以停止反應(yīng)，并立即儲(chǔ)存在4℃下備用。

1.4.4 乳酸菌發(fā)酵柚子核中多肽的提取

以1∶20的料液比加入超純水，于溫度37℃，轉(zhuǎn)速40 r/min下用恒溫?fù)u床提取1 h；提取后倒入離心管以轉(zhuǎn)速1 300 r/min離心20 min；取上清液定容至50 mL，并立即儲(chǔ)存在4℃下以備后續(xù)測(cè)定使用。對(duì)于不需測(cè)定的多肽提取液，放置于-40℃條件下保存，后用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，得到多肽粗樣，并立即儲(chǔ)存在-40℃冰箱中。

1.4.5 多肽得率的測(cè)定

為避免蛋白質(zhì)對(duì)多肽含量檢測(cè)的影響，取1 mL上述提取液，加入10%（W/V） 的三氯乙酸（TCA） 水溶液1 mL混合均勻，靜置10 min，以轉(zhuǎn)速1 100 r/min離心30 min，取上清液。

多肽得率的測(cè)定使用福林酚法[9-10]，具體包括以下步驟：

（1） 溶液配置。福林試劑A液：0.8 g NaOH和4 g無(wú)水Na2CO3溶于200 mL超純水；福林試劑B液：2 g酒石酸鉀鈉溶于200 mL超純水；福林試劑C液：1 g CuSO4·5H2O溶于200 mL超純水；福林試劑D液：192 mL福林試劑A溶液與4 mL福林試劑B液和4 mL福林試劑C液的混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用；福林試劑E液：Folin-Phenol試劑。

（2） 吸收光譜的測(cè)定。配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.5 mL加入4 mL試劑D液，于室溫下靜置10 min，然后加入試劑E液0.5 mL并混勻，于40℃下保溫20 min，室溫冷卻，于波長(zhǎng)300～900 nm處掃描，得到其吸收光譜曲線，確定測(cè)定波長(zhǎng)。

（3）谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。配置質(zhì)量濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mg/mL谷胱甘肽溶液，各取1 mL，分別加入8 mL試劑D液，于室溫下靜置10 min，然后加入試劑E液1 mL并混勻，于40℃下保溫20 min，室溫冷卻，于波長(zhǎng)749 nm處測(cè)定各管溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4） 多肽得率的測(cè)定。取1 mL已加入TCA去除蛋白的樣品，加入8 mL試劑D液，于室溫下靜置10 min，然后加入試劑E液1 mL并混勻，于40℃下保溫20 min，室溫冷卻，于波長(zhǎng)749 nm處測(cè)定各管溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出試樣溶液的多肽質(zhì)量濃度。

式中：ρ——樣品液中多肽質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品液體積，mL；

m——初始柚子核粉末的質(zhì)量，mg。

1.4.6 乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝的單因素試驗(yàn)

（1）發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝影響。準(zhǔn)確稱取1 g柚子核粉，在發(fā)酵時(shí)間為50 h，料液比為1∶11，接種量為40%的情況下，分別于10，14，18，22，26℃下發(fā)酵。以多肽得率的極大值為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵溫度。

（2）發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝影響。準(zhǔn)確稱取1 g柚子核粉，在發(fā)酵溫度為18℃，料液比為1∶11，接種量為40%的情況下，分別發(fā)酵20，35，50，65，80 h。以多肽得率的極大值為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

（3）料液比對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝影響。準(zhǔn)確稱取1 g柚子核粉，在發(fā)酵溫度為18℃，發(fā)酵時(shí)間為50 h，接種量為40%的情況下，分別按照 1∶7，1∶9，1∶11，1∶13，1∶15（g∶mL） 的料液比添加超純水。以多肽得率的極大值為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵液料比。

（4）接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝影響。準(zhǔn)確稱取1 g柚子核粉，在發(fā)酵溫度為18℃，發(fā)酵時(shí)間為50 h，料液比為1∶11的情況下，分別按照30%，35%，40%，45%，50%添加乳酸菌菌懸液。以多肽得率的極大值為指標(biāo)，確定最佳接種量。1.4.7 響應(yīng)面優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0（MSR） 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件，選用Box-behnken（BB） 模型，以發(fā)酵后柚子核多肽得率為響應(yīng)面值Y，發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、料液比（C）、接種量（D）為自變量，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)并確定乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽的最優(yōu)工藝條件[11]。并根據(jù)響應(yīng)面模型方差分析表，利用JMP14軟件進(jìn)一步分析各因素之間的交互作用關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽吸收光譜掃描的測(cè)定結(jié)果

谷胱甘肽光譜掃描曲線見(jiàn)圖1。

由圖1可得，1 mg/mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在300～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定其最大吸收峰在749 nm處，并將此波長(zhǎng)確定為以下各步驟中多肽含量的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

749 nm測(cè)定波長(zhǎng)的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在測(cè)定波長(zhǎng)為749 nm時(shí)，谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.388 4X+0.033 4。相關(guān)系數(shù)R2=0.999，直觀地說(shuō)明了在749 nm下，吸光度與谷胱甘肽質(zhì)量濃度有很好的線性關(guān)系，兩者相關(guān)性強(qiáng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作誤差小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，為后續(xù)多肽得率的測(cè)定提供依據(jù)。

2.3 乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝的影響

發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在10～14℃的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，多肽得率隨發(fā)酵溫度的增加而提高，在14℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，多肽得率為5.52%±0.12%，發(fā)酵溫度大于14℃時(shí)，隨溫度增加而降低，最后趨于平緩。這是由于大多乳酸菌均為嗜冷桿菌屬[12]，在較低溫度時(shí)生長(zhǎng)代謝旺盛，產(chǎn)生的蛋白酶豐富，可對(duì)天然產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，有助于多肽得率的提高，而在較高溫度時(shí)乳酸菌生長(zhǎng)緩慢，多肽得率較低。數(shù)據(jù)用3次重復(fù)的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD） 表示，用SPSS 17.0軟件（IBM Amonk） 計(jì)算鄧肯檢驗(yàn)的顯著性差異可得，發(fā)酵溫度在14℃時(shí)與其他溫度條件下的多肽得率有顯著差異（p＜0.05）。因此，初步確定14℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽得率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在20～35 h的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，多肽得率隨發(fā)酵時(shí)間的增加而提高，發(fā)酵時(shí)間在35 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，多肽得率為4.40%±0.09%，發(fā)酵時(shí)間超過(guò)35 h后，隨著發(fā)酵時(shí)間增加多肽得率降低。該乳酸菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為30～36 h，其在生長(zhǎng)過(guò)程中主要利用纖維、乳糖、淀粉、寡糖[13-14]，而在柚子核粉作為營(yíng)養(yǎng)源的發(fā)酵過(guò)程中，在35 h達(dá)到一個(gè)菌株生長(zhǎng)與物質(zhì)消耗的平衡點(diǎn)，因此在35 h時(shí)對(duì)應(yīng)的多肽得率最大。數(shù)據(jù)用3次重復(fù)的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，用SPSS 17.0軟件（IBM Amonk） 計(jì)算鄧肯檢驗(yàn)的顯著性差異可得，發(fā)酵時(shí)間在35 h時(shí)與其他發(fā)酵時(shí)間下的多肽得率有顯著差異（p＜0.05）。因此，初步確定35 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.3.3 料液比對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝的影響

料液比對(duì)乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽得率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，料液比為1∶7～1∶11時(shí)，多肽得率隨著添加的超純水比例增加而逐漸增加，料液比超過(guò)1∶11時(shí)，多肽得率幾乎穩(wěn)定為4.79%±0.14%。原料在形成合適的質(zhì)量濃度梯度時(shí)，將促進(jìn)柚子核中水溶性物質(zhì)溶出，包括提供乳酸菌生長(zhǎng)代謝所需的碳源，在1∶11的料液比時(shí)剛好達(dá)到飽和，在1∶11的料液比后，增加超純水的體積對(duì)多肽得率幾乎沒(méi)影響。數(shù)據(jù)使用3次重復(fù)的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD） 表示，用SPSS 17.0軟件（IBMAmonk） 計(jì)算鄧肯檢驗(yàn)的顯著性差異可得，料液比為1∶11與1∶7，1∶9條件下的多肽得率有顯著差異，與1∶13，1∶15條件下的多肽得率無(wú)顯著差異（p＜0.05）。因此，初步確定1∶11為最佳料液比。

2.3.4 接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽工藝的影響

接種量對(duì)乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽得率的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，接種量為30%～45%時(shí)，多肽得率隨著接種量的增加而逐漸增加，當(dāng)接種量為45%時(shí)多肽得率達(dá)到最大值為4.68%±0.10%，當(dāng)接種量大于45%后，多肽得率開(kāi)始出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。這是由于提供乳酸菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在接種量為45%時(shí)達(dá)到平衡，當(dāng)接種量大于45%時(shí)會(huì)出現(xiàn)乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致多肽得率趨于下降。數(shù)據(jù)用3次重復(fù)的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，用SPSS 17.0軟件（IBM Amonk） 計(jì)算鄧肯檢驗(yàn)的顯著性差異可得，接種量在40%時(shí)與30%，35%條件下的多肽得率有顯著差異，與45%，50%條件下的多肽得率無(wú)顯著差異（p＜0.05）。因此，初步確定40%為最佳接種量。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 因素的選取及方案

綜合上述單因素的試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比、接種量這4個(gè)因素作為響應(yīng)面分析試驗(yàn)的因素，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法，利用Design Expert 8.0（MSR） 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽的工藝。

響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

以發(fā)酵后柚子核多肽得率為響應(yīng)面值Y，發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、料液比（C）、接種量（D）為自變量。其中1-24號(hào)為析因試驗(yàn)，25-29號(hào)為中心試驗(yàn)。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2 二次方程數(shù)學(xué)模型的建立

針對(duì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design Expert進(jìn)行回歸擬合分析，得到各發(fā)酵條件和多肽得率之間的二次多項(xiàng)式方程模型為Y=4.88-0.17A+0.15B+0.23C+0.036D。由方程中一次項(xiàng)系數(shù)可得出影響乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽得率的因素由強(qiáng)到弱依次為C＞A＞B＞D，即料液比＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量。

2.4.3 方差分析結(jié)果

對(duì)模型的回歸方程進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)二次回歸模型的顯著性。

回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

回歸模型的方差分析與顯著性檢驗(yàn)：利用Design Expert 8.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，以確定每個(gè)因素對(duì)柚子核多肽提取率的影響程度，同時(shí)也檢驗(yàn)回歸方程的有效性。由表5可知，RSM獲得的模型p值為0.020 1（p＜0.05），顯著；失擬項(xiàng)p值為0.453 8（p＞0.05），不顯著。因此，該模型成立，適合用于乳酸菌發(fā)酵柚子核制備多肽的得率響應(yīng)值的預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.4.4 響應(yīng)面因素交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面模型方差分析表，利用JMP 14[15]分析得出發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比、接種量之間的交互作用關(guān)系圖，作進(jìn)一步分析。

發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比和接種量間的交互作用圖見(jiàn)圖7。

交互作用關(guān)系圖中，曲線的彎曲程度越大，表明這種因素隨著相應(yīng)變量因素的變化而明顯變化[16]。由圖7可知，隨發(fā)酵時(shí)間的變化，不同發(fā)酵溫度、不同發(fā)酵料液比和不同接種量之間多肽得率變化較大，每條曲線的斜率變化較大，因此發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度、料液比、接種量之間交互作用均明顯。

2.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及模型驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)所建立的模型，得到最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度10℃，發(fā)酵時(shí)間40 h，料液比1∶15，接種量50%，在此條件下柚子核多肽理論提取率為7.13%。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，柚子核活性肽實(shí)際平均提取率為7.04%±0.23%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.26%。表明響應(yīng)面法優(yōu)化所得最佳工藝條件可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

以乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系為研究對(duì)象，通過(guò) Design Expert 8.09（MSR） 軟件的 Box-benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系制備多肽的工藝。首先，通過(guò)單因素試驗(yàn)，分別研究乳酸菌發(fā)酵柚子核過(guò)程中發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比、接種量4個(gè)因素對(duì)柚子核多肽得率的影響。在此基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比、接種量作為試驗(yàn)因子，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)后得出，制備乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中活性多肽的最佳工藝為發(fā)酵溫度10℃，發(fā)酵時(shí)間40 h，料液比1∶15，接種量50%，經(jīng)過(guò)方差分析和分子刻畫(huà)器顯示模型擬合度較高。通過(guò)驗(yàn)證性試驗(yàn)證實(shí)此工藝條件下多肽得率為7.04%±0.23%，與模型的預(yù)測(cè)值7.13%十分接近。由此可見(jiàn)，該模型能有效指導(dǎo)乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中活性多肽制備工藝條件的優(yōu)化，并證明通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中活性多肽的制備在實(shí)踐上是可行的，這為進(jìn)一步研究乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽的生理活性奠定基礎(chǔ)。

柚果加工，尤其是有關(guān)柚核、果皮等的綜合利用已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外科技工作者的關(guān)注。因此，利用響應(yīng)面優(yōu)化乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中活性多肽的提取，將為進(jìn)一步研究乳酸菌-柚子核共發(fā)酵體系中多肽的生理活性奠定基礎(chǔ)，有助于提高金柚加工過(guò)程中副產(chǎn)物的高值化利用，促進(jìn)金柚產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型與升級(jí)，未來(lái)勢(shì)必將加大對(duì)金柚加工副產(chǎn)物柚子核的綜合利用。