養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)常見病原菌調(diào)查

張業(yè)懷

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧530007）

細(xì)菌在自然界分布極為廣泛，存在于土壤、水、空氣、動(dòng)物的體表及其與外界自然環(huán)境相通的腔道內(nèi)，這些細(xì)菌大部分對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)是有益的，但也有一部分是病原菌或條件性致病菌，對(duì)動(dòng)物有致病性。細(xì)菌的存活時(shí)間受到外界環(huán)境中包括溫度、濕度、光照、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酸堿度及細(xì)菌之間的相互作用等各種因素的影響，不同的細(xì)菌因其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性不相同而對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力也不一樣，導(dǎo)致不同的環(huán)境中存在的細(xì)菌種類也不同。

近年來，高職院校養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)引進(jìn)、飼養(yǎng)動(dòng)物的種類及數(shù)量隨著畜牧獸醫(yī)專業(yè)招生規(guī)模的擴(kuò)大而不斷增加，由此造成周圍環(huán)境細(xì)菌數(shù)量和種類也發(fā)生相應(yīng)的變化，病原菌及一些條件性致病菌在一定條件下導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，不僅影響動(dòng)物的生長(zhǎng)，而且也威脅著師生的安全。為此，本課題組開展養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)環(huán)境常見病原菌種類和數(shù)量的調(diào)查，以全面掌握養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)周圍環(huán)境的細(xì)菌污染現(xiàn)狀及致病菌的種類，為養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)衛(wèi)生消毒及飼養(yǎng)管理制度的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采集廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)動(dòng)物欄舍中的空氣、欄舍排污水及近處的池水、欄舍周邊土壤的樣品。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

普通瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖血清瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨肉湯培養(yǎng)基、兔新鮮血漿及3% H2O2溶液均由本實(shí)驗(yàn)室提供。厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基、牛奶培養(yǎng)基、SS瓊脂、血平板、TCBS瓊脂、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、M.S.P培養(yǎng)基、蛋白胨酵母膏平板、剛果紅培養(yǎng)基、BS瓊脂、HE瓊脂、肝湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、甘露醇卵黃多粘素（MYP）平板及生化鑒定所用各種細(xì)菌微量發(fā)酵管、氧化酶試驗(yàn)試劑及硝酸鹽還原試驗(yàn)試劑等均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小白鼠（約16g）均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)。

1.4 采樣時(shí)間

2019年3～5月，每種樣本采集4次，每次每種樣本分3個(gè)采樣點(diǎn)，采樣時(shí)間均為10:00～11:30。

1.5 采樣方法

1.5.1 空氣樣本采用平皿沉降法將普通瓊脂培養(yǎng)基平板分別放置于動(dòng)物欄舍內(nèi)室中央、料槽邊及走道處30min后取出，37℃培養(yǎng)24h[1]。

1.5.2 水樣本取動(dòng)物欄舍近處的池塘水，沖洗欄舍排污水。池塘水從水深約5cm處用滅菌的三角瓶分3個(gè)點(diǎn)取水，而欄舍排污水直接用滅菌平皿分3個(gè)點(diǎn)取，最后混在一起，置實(shí)驗(yàn)室冰箱4℃保存，待檢。

1.5.3 土壤樣本在動(dòng)物欄舍圍墻外200cm有裸露土壤處取3個(gè)有代表性的點(diǎn)，先挖去表土，取深5cm左右的土壤約50g，并且3個(gè)點(diǎn)取樣量一樣，分別置于已滅菌的三角瓶中，置實(shí)驗(yàn)室冰箱4℃保存，待檢。

1.6 樣本處理

空氣樣本直接放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。而水樣本和土壤樣本都需要預(yù)稀釋處理。對(duì)水樣本，吸取1mL水樣加入到裝有9mL滅菌生理鹽水試管中，混勻，按倍比稀釋法依次稀釋成10－2～10－6濃度水樣懸液，取最后3個(gè)稀釋度各1mL放入滅菌平皿中，倒入預(yù)先滅菌冷卻到45℃普通瓊脂培養(yǎng)基，混勻，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿，37℃培養(yǎng)48h。對(duì)土壤樣本，則加入滅菌生理鹽水稀釋到250mL，搖勻，靜置5min，無菌吸取5μL懸液分別接種于血平板、SS平板、麥康凱平板及普通瓊脂平板，每種平板2個(gè)，一個(gè)放入?yún)捬醐h(huán)境，并與另一個(gè)同置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

1.7 細(xì)菌分離培養(yǎng)

1.7.1 細(xì)菌的分離與純化接種樣本經(jīng)過37℃培養(yǎng)24～48h后，挑取典型單個(gè)菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色、鏡檢。再挑取可疑菌株單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，分別接種血平板、肉湯培養(yǎng)基及相應(yīng)的鑒別培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。

1.7.2 分離菌株生化鑒定對(duì)從3類樣本中分離出的14種菌株進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果具體見表1。

1.8 細(xì)菌鑒定

根據(jù)革蘭氏染色鑒定結(jié)果、鑒別培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)特征及生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定[2]。鑒定細(xì)菌參照文獻(xiàn)[3，4]。

1.9 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

對(duì)從環(huán)境中分離獲得的61株菌株（具體見表2），按常規(guī)報(bào)道的方法進(jìn)行小白鼠致病性實(shí)驗(yàn)[5]。

將61株分離菌分別接種肉湯培養(yǎng)基，根據(jù)不同菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，然后用滅菌生理鹽水稀釋，用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法測(cè)定并稀釋成含菌量為106CFU/mL的新鮮肉湯菌懸液，接種量為0.5mL/只、每株細(xì)菌做3個(gè)重復(fù)。葡萄球菌菌液采用腹部皮下注射，對(duì)照組腹腔注射等量的滅菌生理鹽水；產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液采用尾靜脈注射，對(duì)照組尾靜脈注射滅菌生理鹽水，10min后全部處死，立即放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)8～12h[6]；破傷風(fēng)桿菌要先將分離菌株接種到厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后采用后腿肌肉注射，對(duì)照組注射滅菌生理鹽水；其余的分離菌液全部采用腹腔注射，對(duì)照組注射滅菌生理鹽水。

接種后觀察小白鼠活動(dòng)變化及發(fā)病死亡情況，并對(duì)死亡的小白鼠進(jìn)行剖檢，觀察各臟器病變，同時(shí)取病變部組織涂片及染色鏡檢并分離鑒定細(xì)菌，若結(jié)果與注入細(xì)菌相同，則判定為病原菌。未發(fā)病的繼續(xù)觀察飼養(yǎng)至兩周。

表1 可疑菌株生化試驗(yàn)及鑒別培養(yǎng)情況

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

整個(gè)試驗(yàn)共采集4批樣品，空氣樣本、水樣本及土壤樣本各12份，共分離出61株細(xì)菌，詳見表2。

表2 養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中細(xì)菌的種類情況

2.1.1 空氣樣本細(xì)菌分離鑒定結(jié)果經(jīng)鑒定，從空氣樣本中分離獲得23株細(xì)菌，其中革蘭氏陽性菌（G+）14株（60.87%），革 蘭 氏 陰 性 菌（G-）9株（39.13%），革蘭氏陽性菌中以葡萄球菌數(shù)量最多，獲8株菌，占34.78%（8/23），具體結(jié)果見表3。

表3 空氣樣本中各種細(xì)菌檢出率

2.1.2 水樣本細(xì)菌分離鑒定結(jié)果經(jīng)鑒定，從采集的水樣本中分離到18株細(xì)菌，其中G+菌7株（38.89%），G-菌11株（61.11%）。從水樣本中分離到的細(xì)菌主要是G-菌，且多數(shù)是些條件致病菌，結(jié)果見表4。

表4 水樣本中各種細(xì)菌檢出率

2.1.3 土壤樣本細(xì)菌分離鑒定結(jié)果經(jīng)鑒定，從采集土壤樣本中分離到20株細(xì)菌，其中G+菌14株（70.00%），G-菌6株（30.00%）。除了常見的細(xì)菌外，還分離到一些不常見的細(xì)菌如破傷風(fēng)桿菌和李氏桿菌，結(jié)果見表5。

表5 土壤樣本中各種細(xì)菌檢出率

2.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

結(jié)果表明，部分分離菌株對(duì)小白鼠有致病性，致病性菌株占菌株總數(shù)的36.07%。61株分離菌中有些致病力強(qiáng)，有些無致病性，致病率比較高的是產(chǎn)氣莢膜 梭菌、破傷風(fēng)桿菌、李氏桿菌及沙門氏菌，結(jié)果見表6。

表6 環(huán)境細(xì)菌致病性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本次試驗(yàn)從3類樣本中共分離出14種細(xì)菌，61個(gè)菌株，其中革蘭氏陰性菌26株（42.62%），革蘭氏陽性菌35株（57.38%）。空氣樣本檢出7種細(xì)菌，共23株細(xì)菌，以葡萄球菌居多，占34.78%（8/23）；水樣本共分離出11種細(xì)菌，以G－檢出率最多,共分離出11株,占61.11%（11/18）；土壤樣本分離出9種細(xì)菌，除常見細(xì)菌外，還分離到破傷風(fēng)桿菌和李氏桿菌，應(yīng)引起高度重視，并且葡萄球菌和大腸桿菌檢出率最多（15.00%）。在所采集的3種環(huán)境樣品中，以葡萄球菌分離率最高，占19.67%（12/61），說明葡萄球菌為環(huán)境的主要污染菌，提示外科手術(shù)及創(chuàng)傷處理時(shí)應(yīng)遵守?zé)o菌操作原則，使用敏感抗菌藥物預(yù)防術(shù)后感染，平時(shí)要加強(qiáng)對(duì)糞污、廢棄物及病死動(dòng)物尸體進(jìn)行無害化處理，要加強(qiáng)周圍環(huán)境的消毒。小白鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，61株分離菌中有36.07%（22/61）菌株有致病性，39株沒有致病性，表明養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中的細(xì)菌種類多樣且存在大量的致病菌，提示養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)要注意做好細(xì)菌性疾病的防治工作，平時(shí)要保持動(dòng)物欄舍清潔干燥，定期監(jiān)測(cè)環(huán)境中的細(xì)菌種類，定期消毒，特別是氣溫變化、環(huán)境潮濕時(shí)更要嚴(yán)格消毒，并輪換使用不同品牌不同類別的消毒藥。

此次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，致病菌中有1株是蠟樣芽孢桿菌，提示應(yīng)重視當(dāng)蠟樣芽孢桿菌用作益生菌時(shí)的安全性檢測(cè)，以防止致病性蠟樣芽孢桿菌的潛在危害。此外，在分離到的致病菌中有4株是產(chǎn)氣莢膜梭菌，此菌形成芽胞后對(duì)環(huán)境因素及消毒藥抵抗力較強(qiáng)，在自然界長(zhǎng)期存活，感染途徑主要是通過消化道，提示平時(shí)要搞好環(huán)境衛(wèi)生和保證飼料、飲水的清潔，以預(yù)防本病發(fā)生。

本次試驗(yàn)采集的樣本是在雞、牛的欄舍進(jìn)行取樣，采集樣本有一定的局限性，其它如豬、馬動(dòng)物舍細(xì)菌污染情況怎樣，致病性情況如何，需要日后有待進(jìn)一步的探究。