乳鐵蛋白對幼年大鼠骨健康影響

趙添玉,鄒丹陽，謝銀丹,許 巖,商佳琦,劉 寧

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

骨是一種高活性結(jié)締組織,可以通過骨代謝及骨重塑來修復(fù)自身微損傷,保持骨結(jié)構(gòu)、荷載及鈣含量的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[1],同時骨也作為內(nèi)分泌器官調(diào)控代謝過程[2],是維持人體生命的重要器官。從新生兒時期開始,骨量隨年齡的增長而增加,直到青年時期骨發(fā)育成熟,骨量達到峰值[3]。研究發(fā)現(xiàn),青少年時期注意提高骨量,能夠在青年時期獲得個體峰值骨量[4]。因而青少年時期骨的生長發(fā)育對骨的成熟至關(guān)重要。有研究指出,青少年時期的骨密度(Bone mineral density,BMD)決定了成年后的骨量峰值和隨后的骨丟失速率[5]。BMD降低會導(dǎo)致骨量不足,從而引發(fā)佝僂病、軟骨病等一系列骨疾病[6],嚴重影響青少年的骨健康。在這一時期,營養(yǎng)的補充是影響骨量峰值的重要因素[5],攝入營養(yǎng)物質(zhì)能夠提高骨量峰值,促進骨的形成。因此尋求一種天然的功能性營養(yǎng)物質(zhì)來提高青少年BMD,增加骨形成,對提高骨量、預(yù)防青少年骨折與中老年骨質(zhì)疏松癥等骨疾病以及維持骨健康有著重要意義。

乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)是一種骨調(diào)節(jié)效應(yīng)物[7],它是一種80 kDa的鐵結(jié)合糖蛋白[8],存在于母乳、炎性反應(yīng)高發(fā)區(qū)以及嗜中粒細胞的次級顆粒中,屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員之一[9],其具有抗炎、抗腫瘤[10]、抗癌[11]、抗病毒[12]、抗微生物活性[13]、抑菌[14]、免疫調(diào)節(jié)[15]、促進神經(jīng)發(fā)育和認知[16]、促進鐵吸收[17]以及成骨活性[18-19]等多重作用。隨著對LF研究的深入,越來越多的學(xué)者將注意力轉(zhuǎn)移到了LF抑制破骨、促進成骨作用的研究。在體外細胞實驗中證實,LF可以作為有效促進骨生長的合成因子[20],促進骨形成細胞——成骨細胞(Osteoblast,OB)的增殖和分化[21],并有效地抑制骨吸收細胞——破骨細胞(Osteoclast,OC)的形成[22],從而在OB和OC的相互作用下調(diào)節(jié)骨量平衡。而在體內(nèi)實驗中,國內(nèi)外對LF的研究多集中于治療骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨疾病以及新生兒的免疫等領(lǐng)域[23-24],但是對青少年攝入LF后骨形成及骨量的影響目前還沒有報道。因此研究青少年時期攝入LF對骨的影響機制,對開發(fā)LF應(yīng)用于青少年的營養(yǎng)食品具有重要意義。

本研究以4 周齡幼年大鼠骨生長的模型為研究對象,通過研究補充LF對幼年大鼠體重、臟體比、BMD、骨微觀結(jié)構(gòu)以及血清和股骨骨髓組織中骨吸收標志物TRACP、MMP-9、CTSK及骨代謝過程中RANKL、OPG和OPG/RANKL的影響,探究LF對大鼠幼年時期骨健康的作用,為其應(yīng)用于開發(fā)青少年骨健康食品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LF 純度為96.3%,新西蘭霍基蒂卡韋斯特蘭乳制品有限公司;大鼠TRACP酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠MMP-9酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠CTSK酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠RANKL酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠OPG酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;Trizol 美國Invitrogen公司;紅細胞裂解液 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;PBS 美國Gibco公司;Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 大連寶生物工程有限公司;GoTaq? qPCR Master Mix 美國Promega公司;40 只幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,4 周齡(鼠的周齡參考了Sengupta[25]的研究,研究發(fā)現(xiàn),大鼠在4～5 周齡時(約35 d)進入青春期,由于大鼠生長期發(fā)育迅速,根據(jù)青春期前后計算大鼠在4～8 周齡相當(dāng)于人9～18 歲青少年時期。因此選擇4 周齡大鼠喂養(yǎng)30 d作為幼年大鼠骨生長的研究模型進行研究) 北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號scxk(京)2016-0006,。

TE 601-1電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;Skyscan1276Micro-CT 美國bruker公司;DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;WIGGENS Vortes3000渦旋振蕩器 北京桑翌實驗儀器研究所;GL-21M離心機 上海市離心機械研究所;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;Step One Plus TM熒光定量PCR儀 Life Technologies/美國;UV-2401PC紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗設(shè)計 將大鼠安置在(24±2) ℃溫度和50%±10%相對濕度的動物房間內(nèi),改變12/12 h的光/暗周期。動物實驗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理學(xué)的認可下進行,動物護理和實驗按照東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室動物護理和使用指南進行。大鼠飼喂標準大鼠飼料7 d后,隨機分為對照組(0 mg/kg bw/d)、LF低劑量組(100 mg/kg bw/d)、LF中劑量組(500 mg/kg bw/d)和LF高劑量組(1000 mg/kg bw/d),每組10只,對照組灌胃等量的蒸餾水。每天測量大鼠固體飲食的攝入量。實驗第30 d,大鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg bw)麻醉,腹主動脈采血后將大鼠處死,全血3000 r/min、15 min離心分離獲得血清,-80 ℃保存。解剖分離各組大鼠左側(cè)股骨,4%多聚甲醛固定;取大鼠右側(cè)股骨提取骨髓[26],將骨髓放置液氮中速凍后迅速放入-80 ℃保存。

灌胃LF的劑量參考Shumake等[27]文獻,假設(shè)嬰兒平均每天攝入母乳為780 mL,按照母乳中LF濃度為1.0 g/L,嬰兒體重為3.5 kg,嬰兒平均每天LF攝入量為223 mg/kg。根據(jù)人和大鼠的等效計量,體表面積轉(zhuǎn)換[28-29],換算成大鼠等效劑量為743～750 mg/kg。此外,參考了Cerven等[28]的LF大鼠急性毒性實驗,1000 mg/kg bw/d為最大安全劑量。因此設(shè)置了500 mg/kg bw/d為中劑量組,100和1000 mg/kg bw/d分別為低和高劑量組。

1.2.2 大鼠的體重測量 灌胃前稱量大鼠體重,之后每隔10 d稱量各組大鼠體重,記錄體重數(shù)據(jù)并分析。

1.2.3 大鼠臟體比值計算 取大鼠肝、脾和腎稱重,計算出各組內(nèi)臟的比值:

1.2.4 大鼠股骨顯微CT檢測 取多聚甲醛固定好的各組大鼠左側(cè)股骨,采用Micro-CT對股骨的顯微結(jié)構(gòu)進行評價。分別將待測股骨放入Micro-CT儀的樣本杯中,進行掃描。掃描條件為:電壓75 kV,電流200 μA,180 °旋轉(zhuǎn)掃描,掃描時間為17 min,曝光時間460 ms,幀平均1 幀,角度增益0.4 °,分辨率6 μm。對同一樣品掃描獲得1027 張不同角度的4032×2688像素的圖片。通過NRECON程序?qū)呙璧玫降臉悠沸畔⒃谙嗤瑮l件下進行三維CT重建,而后選取股骨遠端距生長板(骨骺)0.77～3.85 mm的骨組織為興趣區(qū)域(Region of interest,ROI)進行分析,如圖1。定量分析使用CTAn軟件,分析參數(shù)包括BMD、骨小梁數(shù)量(Trabecular bone number,Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular bone thickness,Tb.Th)和骨小梁分離度(Trabecular bone space,Tb.Sp)。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

圖1 骨小梁的垂直范圍(參照標準生長版參考水平定義)Fig.1 The vertical extent of the trabecular ROIs(defined withreference to a standard growth plate reference level)注:ROI區(qū)域參考Method for ex-vivo micro-CTanalysis of rat bone(proximal tibia,distal femur)中圖1區(qū)域分析。

1.2.5 大鼠血清中骨代謝生化指標檢測 取-80 ℃保存的大鼠血清,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測大鼠血清中骨吸收指標TRACP、MMP-9、CTSK和RANKL和骨形成指標OPG水平,操作步驟嚴格按照說明書進行。應(yīng)用Bio-RAD酶標儀測量450 nm處吸光度(A)值,并將其在標準曲線下?lián)Q算成濃度值。

1.2.6 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測大鼠骨髓中骨代謝相關(guān)基因的表達 取-80 ℃保存的股骨骨髓,液氮處理骨髓組織,用Trizol法提取骨髓總RNA。具體操作如下:首先取50～100 mg右腿股骨骨髓組織(新鮮或-80 ℃及液氮中保存的組織均可)置1.5 mL離心管中,加入適量紅細胞裂解液充分裂解,PBS洗滌后,加入1 mL Trizol充分勻漿,室溫靜置5 min;加入0.2 mL氯仿,振蕩15 s,靜置2 min;4 ℃,12000×g離心15 min,取上清;加入0.5 mL異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10 min;4 ℃,12000×g離心10 min,棄上清;加入1 mL 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀;4 ℃,7500×g離心5 min,棄上清;晾干,加入適量的DEPC H2O溶解(65 ℃促溶10～15 min)。

采用RT-PCR法檢測,使用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒,按說明書操作將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(混合后的反應(yīng)體系立即在37 ℃水浴中反應(yīng)15 min,然后85 ℃,5 s滅酶,逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 4 ℃存放)。按照GoTaq? qPCR Master Mix說明書的方法配制PCR熒光定量反應(yīng)液,使用Step One PlusTMSystem系統(tǒng)進行各基因PCR擴增,反應(yīng)條件為:預(yù)變性:95 ℃,2 min(1個循環(huán));PCR:變性:95 ℃,15 s,延伸60 ℃,60 s(40 個循環(huán));融解曲線:95 ℃,15 s;60 ℃,15 s;95 ℃,15 s(1個循環(huán))。以GAPDH為內(nèi)參,引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成,擴增條件:95 ℃,2 min;95 ℃,30 s;60 ℃,30 s(40 個循環(huán))?；蛞镄蛄斜硪姳?。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 補充LF對幼年大鼠體重的影響

對幼年大鼠灌胃LF后的體重變化結(jié)果見表2。由表2可知,LF低劑量組、LF中劑量組和LF高劑量組幼年大鼠的體重與對照組生長趨勢相近,并無顯著差異(P>0.05),由此說明,補充LF對幼年大鼠的體重?zé)o顯著影響,這與陳科等[30]研究結(jié)果一致。

表2 LF對幼年大鼠體重的影響Table 2 Effect of LF on body weight of juvenile rats

2.2 補充LF對幼年大鼠臟體比的影響

由表3可知,LF低劑量組、LF中劑量組和LF高劑量組幼年大鼠與對照組相比,其肝體比、脾體比和腎體比均無顯著性差異(P>0.05),這與Cerven等[28]的急性毒性試驗研究結(jié)果一致,說明LF對幼年大鼠主要臟器的重量無明顯影響,攝入LF是安全的。

表3 LF對幼年大鼠臟體比的影響Table 3 Effect of LF on the ratio of viscera in juvenile rats

2.3 補充LF對幼年大鼠股骨BMD和骨微觀結(jié)構(gòu)的影響

BMD是反映骨健康的重要標志[31];Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp等靜力學(xué)指標反映單位面積內(nèi)骨小梁的連接狀況和骨微觀結(jié)構(gòu)特征,骨的結(jié)構(gòu)越優(yōu)化,抗骨折能力就越強,這幾個指標之間相互聯(lián)系,密不可分。為了研究補充LF對幼年大鼠BMD和骨微觀結(jié)構(gòu)的影響,選取大鼠股骨遠端距生長板(骨骺)0.77～3.85 mm的骨組織Mirco-CT掃描分析,如圖2(A、B)所示。

根據(jù)圖2(C)可知,LF低劑量組幼年大鼠BMD與對照組相比無顯著差異(P>0.05),而LF中、高劑量組幼年大鼠BMD與對照組相比顯著升高(P<0.05),說明中、高劑量LF能夠顯著增加幼年大鼠BMD,從而增加大鼠骨量。根據(jù)圖2(D～F)可知,LF低劑量組幼年大鼠Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp與對照組相比無顯著差異(P>0.05),而LF中、高劑量組Tb.N和Tb.Th與對照組相比顯著升高(P<0.05),Th.Sp顯著降低(P<0.05),這是因為骨重塑是一種動態(tài)平衡過程,補充LF之后,骨吸收減少,骨形成增加,促使骨小梁數(shù)量增加,厚度變厚,間距減小,進而達到穩(wěn)定其平衡的作用[32]。由此說明LF可增加幼年大鼠骨形成,改善骨小梁的微體系結(jié)構(gòu),減少幼年大鼠的骨吸收。Guo等[33]也證實,飼喂去卵巢大鼠LF可增加骨量,改善骨微結(jié)構(gòu),防止BMD降低,并增加骨骼機械強度,從而增加骨形成,減少骨吸收。

本研究LF中、高劑量組與對照組相比出現(xiàn)明顯的微結(jié)構(gòu)體系差別,LF誘導(dǎo)的BMD增加證實骨重塑空間的下降,說明LF可以促進骨形成和減少骨吸收,推測其作用機制是骨形成大于骨吸收。而本研究中LF低劑量組對骨密度及骨微觀結(jié)果影響不顯著(P>0.05),可能是由于LF需要達到一定的生理濃度才能顯著發(fā)揮其抑制骨吸收促進骨形成的作用。薛英等[34]也發(fā)現(xiàn),劑量較低的LF對去卵巢大鼠骨形成無顯著影響,證實了LF在一定濃度下呈劑量依賴性。

2.4 補充LF對幼年大鼠血清和股骨骨髓組織中TRACP、MMP-9和CTSK水平的影響

骨代謝過程包括骨吸收和骨形成,通過調(diào)節(jié)OC和OB的數(shù)量來維持骨代謝平衡[35],即維持骨吸收和骨形成平衡[36-37]。本研究通過測定幼年大鼠血清和股骨骨髓組織中OC標志物TRACP[38]、MMP-9[39]和CTSK[40]的水平,探究補充LF對幼年大鼠骨代謝的作用。

從圖3(A～C)血清結(jié)果可以看出,與對照組相比,LF低劑量組、LF中劑量組和LF高劑量組幼年大鼠的TRACP血清水平分別降低11%(P<0.05)、56%(P<0.05)和65%(P<0.05)(圖3A),MMP-9分別降低2%(P>0.05)、19%(P<0.05)和23%(P<0.05)(圖3B),CTSK分別降低48%(P<0.05)、60%(P<0.05)和67%(P<0.05)(圖3C)。

從表4結(jié)果可以看出,與對照組比較,LF低劑量組、LF中劑量組和LF高劑量組幼年大鼠股骨骨髓組織中TRACP mRNA相對表達量分別降低14%(P>0.05)、50%(P<0.05)和50%(P<0.05),MMP-9 mRNA相對表達量分別降低23%(P<0.05)、46%(P<0.05)和48%(P<0.05),CTSK mRNA相對表達量分別降低50%(P<0.05)、50%(P<0.05)和50%(P<0.05)。mRNA實驗結(jié)果與血清結(jié)果實驗一致,以上結(jié)果均表明,中、高劑量LF能顯著降低TRACP、MMP-9和CTSK的表達水平。

表4 LF對幼年大鼠股骨骨髓組織中TRACP、MMP-9、CTSK mRNA相對表達量的影響Table 4 Effects of LF on the relative expression of TRACP,MMP-9,CTSK mRNA in the bone marrow tissue of juvenile rats

圖2 LF改善后骨微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The micro-architecture of bone after LF supplement注:(A)大鼠股骨遠端骨組織;(B)骨小梁三維重建;(C)BMD;(D)Tb.N;(E)Tb.Th;(F)Tb.Sp；不同字母代表組間差異顯著(P<0.05)；圖3～圖4、表4～表5同。

TRACP和MMP-9是OC骨吸收過程中重要的骨基質(zhì)降解酶,顯示骨組織代謝中的骨吸收狀況[41],且MMP-9能夠特異性降解非礦化軟骨以及釋放細胞外基質(zhì)結(jié)合的血管內(nèi)皮生長因子,進而直接趨化、活化OC[42],促進OC增殖分化[43],而CTSK是一種降解Ⅰ型膠原蛋白的半胱氨酸蛋白酶,與骨量的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[40]。以上三者均在OC中特異性高表達,能客觀且準確反映出OC的功能活性,它們的變化直觀表明了OC活性。

本研究結(jié)果表明,中、高劑量LF能夠顯著降低幼年大鼠血清和股骨骨髓組織中TRACP、MMP-9、CTSK的水平(P<0.05)。先前的研究指出[34],LF能夠抑制OC的增殖分化,說明LF能夠降低OC活性,減弱骨吸收水平。在骨吸收過程中,OC特異性高表達TRACP、MMP-9和CTSK[44],進一步證明了補充LF能夠降低骨吸收水平,而這一結(jié)果可能是通過減少OC增殖分化進而減少OC形成而實現(xiàn)的。

圖3 LF對幼年大鼠血清中TRACP、MMP-9、CTSK水平的影響Fig.3 Effects of LF on the levels of TRACP,MMP-9,CTSK in serum of juvenile rats注:(A)LF對幼年大鼠血清中TRACP水平的影響;(B)LF對幼年大鼠血清中MMP-9水平的影響;(C)LF對幼年大鼠血清中CTSK水平的影響。

2.5 補充LF對幼年大鼠血清和股骨骨髓組織中RANKL、OPG和OPG/RANKL水平的影響

RANK/RANKL是參與OC生成的重要信號通路[45-46],OB分泌的OC激活因子RANKL與OC前體細胞表面的RANK結(jié)合,促進OC的分化及活性。OPG[47]是一種分泌型糖蛋白,通過與RANKL結(jié)合抑制OC產(chǎn)生。當(dāng)OPG與RANKL競爭性結(jié)合時,阻斷了RANK與RANKL的結(jié)合,減少了OC的形成、分化、存活、活化并誘導(dǎo)OC凋亡,使骨量增加。因此,OPG、RANKL水平與OC的生成密切相關(guān),并最終影響骨代謝平衡。本研究通過測定幼年大鼠血清和股骨骨髓組織中RANKL、OPG和OPG/RANKL的水平,探究補充LF對幼年大鼠骨代謝的作用。

從圖4(A～C)結(jié)果可以看出,與對照組相比,LF低劑量組、LF中劑量組和LF高劑量組幼年大鼠RANKL血清水平分別降低2%(P>0.05)、22%(P<0.05)和26%(P<0.05)(圖4A),OPG分別增加了9%(P>0.05)、23%(P<0.05)和27%(P<0.05)(圖4B),OPG/RANKL比值分別增加11%(P>0.05)、58%(P<0.05)和74%(P<0.05)(圖4C)。

由表5可知,與對照組比較,LF低劑量組、LF中劑量組和LF高劑量組幼年大鼠股骨骨髓組織RANKL mRNA相對表達量分別降低0%(P>0.05)、50%(P<0.05)和50%(P<0.05),OPG mRNA相對表達量分別增加8%(P>0.05)、83%(P<0.05)和88%(P<0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn),LF低、中、高劑量組幼年大鼠股骨骨髓組織中OPG/RANKL mRNA相對表達量分別增加9%(P>0.05)、151%(P<0.05)和152%(P<0.05)。由本研究結(jié)果可知,mRNA實驗結(jié)果與血清結(jié)果實驗一致,均表明了補充中、高劑量LF能夠顯著減少幼年大鼠RANKL表達水平,增加OPG和OPG/RANKL表達水平。

OPG和RANKL的平衡是調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的重要因素,OPG/RANKL的比值更是評價骨形成與骨吸收動態(tài)平衡以及衡量骨量與骨健康的重要標志[31]。本研究結(jié)果表明,LF對幼年大鼠血清及股骨骨髓組織中RANKL的表達有抑制作用,對OPG的表達具有促進作用,同時增加OPG/RANKL比值。Fan、肖暉等[48-49]的報道指出,LF可以抑制大鼠RANKL表達,促進OPG的表達,使OPG/RANKL mRNA比率增加。由此推測LF可能通過增加OPG/RANKL比值促進幼年大鼠骨形成,通過OPG/RANKL通路來抑制OC引起的骨吸收,這可能是補充LF對幼年大鼠骨健康促進和防治骨吸收的一個重要機制。除此之外,LF抑制OC的機制還需要進一步的研究和探討。

圖4 LF對幼年大鼠血清中RANKL、OPG和OPG/RANKL水平的影響Fig.4 Effects of LF on the levels of RANKL,OPG and OPG/RANKL in serum of juvenile rats注:(A)LF對幼年大鼠血清中RANKL水平的影響;(B)LF對幼年大鼠血清中OPG水平的影響;(C)LF對幼年大鼠血清中OPG/RANKL水平的影響。

表5 LF對幼年大鼠股骨骨髓組織中RANKL、OPG和OPG/RANKL mRNA相對表達量的影響Table 5 Effects of LF on the relative expression of RANKL,OPG and OPG/RANKL mRNA in the bone marrow tissue of juvenile rats

3 結(jié)論

本研究研究結(jié)果表明,補充LF后,對幼年大鼠體重及臟體比無顯著影響(P>0.05),說明攝入LF不會影響幼年大鼠體重及其重要器官。補充LF后的幼年大鼠BMD、Tb.N和Tb.Th增加,Tb.Sp減少,大鼠血清和股骨骨髓組織中骨吸收標志物TRACP、MMP-9、CTSK的表達水平減少,RANKL的表達水平降低,同時增加了OPG和OPG/RANKL的水平。說明LF可降低幼年大鼠骨吸收,增加骨形成,改善小梁骨的微體系結(jié)構(gòu),進一步表明LF可能通過提高OPG/RANKL比值增加骨量和減少骨損失,促進骨形成,從而維持骨代謝平衡。本研究中,各組骨吸收與骨形成情況與血清及股骨骨髓組織中相關(guān)因子表達水平結(jié)果相一致,說明各項指標之間具有良好的相互關(guān)聯(lián)性。本研究為日后在青少年時期提高骨量、促進骨形成,減少佝僂病、骨折等疾病，維護骨健康提供實驗基礎(chǔ),為開發(fā)青少年骨健康食品提供理論依據(jù)。