二羥丙酮羰氨反應(yīng)體系中烷基吡嗪生成規(guī)律的研究

羅泰端,林珮璇,張宏婧,陳繼承

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

美拉德反應(yīng)又稱為羰氨反應(yīng),指的是含游離氨基的化合物和還原糖或羰基化合物在常溫或加熱時(shí)發(fā)生的聚合、縮合等反應(yīng),經(jīng)過(guò)復(fù)雜的過(guò)程,最終生成棕色甚至是棕黑色的大分子物質(zhì)類黑精、還原酮、醛和雜環(huán)化合物,這些物質(zhì)是食品色澤和風(fēng)味的主要來(lái)源[1]。羰氨反應(yīng)是現(xiàn)代食品工業(yè)不可或缺的一部分。吡嗪類化合物是羰氨反應(yīng)的生成物之一,也是重要的風(fēng)味成分,廣泛存在于天然食品及食品加工過(guò)程中。

烷基吡嗪(Alkylpyrazine,APZ)是一種以吡嗪為基礎(chǔ)的具有不同取代方式的化合物,具有非常低的氣味閾值[2],有助于食物形成特殊的風(fēng)味[3]。不同的APZ具有不同的香氣特征[4],在食品中具有重要的感官特性。同時(shí),藥理學(xué)研究表明吡嗪類化合物還具有預(yù)防急性酒精性肝損傷、降血壓、降血脂等功效[5-7]。目前所報(bào)道的許多吡嗪類化合物反應(yīng)模型都是在美拉德反應(yīng)體系中建立的,如肽類組分美拉德反應(yīng)體系中吡嗪類化合物的生成,葡萄糖-肌酸酐-氨基酸的美拉德反應(yīng)中可生成十幾種吡嗪產(chǎn)物[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)不同的反應(yīng)底物、溫度等均會(huì)影響APZ的形成[11]。

α-羥基羰基化合物(α-hydroxy carbonyl compound,α-HCC)是APZ形成的關(guān)鍵前體物之一,可與銨鹽通過(guò)羰氨反應(yīng)經(jīng)strecker降解和Amadori重排產(chǎn)生APZ。α-HCC的主要物質(zhì)有三個(gè):3-羥基丁酮(乙偶姻)、二羥基丙酮和羥基乙醛。其中關(guān)于乙偶姻的研究已有諸多報(bào)道,多用于TMP的生成[12-13]。二羥丙酮是最簡(jiǎn)單的酮糖,重要的糖代謝中間產(chǎn)物、醫(yī)藥中間體和功能性添加劑[14],可作為抗病毒試劑,也可作用于食物的保鮮[15]。Adams等[16]研究發(fā)現(xiàn),二羥丙酮和2-氧丙醛為底物反應(yīng)可生成豐富的吡嗪類產(chǎn)物。目前關(guān)于美拉德反應(yīng)體系中生成APZ的研究很多,但多集中于單一吡嗪產(chǎn)物。α-HCC的三個(gè)主要物質(zhì)中只有乙偶姻的相關(guān)研究較為完善,另兩個(gè)物質(zhì)的研究報(bào)道則較少。因此本文以二羥丙酮與銨鹽為底物,探究在α-HCC與銨鹽的反應(yīng)體系中,吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、TMP、2-乙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪10種烷基吡嗪的生成規(guī)律及影響因素。本文進(jìn)一步豐富了在羰氨反應(yīng)體系中對(duì)新的APZ生成模型的研究,顯示了二羥丙酮與銨鹽反應(yīng)生成的吡嗪產(chǎn)物的多樣性,且該模型耗時(shí)短,操作簡(jiǎn)單,對(duì)溫度的要求低,為APZ的生成提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪,二羥丙酮 均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;乙酸銨、氯化銨、硫酸銨、過(guò)硫酸銨、檸檬酸氫二銨均 分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,購(gòu)自德國(guó)默克公司。

高效液相色譜儀 Waters C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm),美國(guó)Waters公司;HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 吉林省胡瑪環(huán)保涂料有限公司;pH計(jì) 瑞士METTLER TOLEDO有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銨鹽種類對(duì)烷基吡嗪的影響 分別將0.77 g乙酸銨、0.53 g氯化銨、1.32 g硫酸銨、2.28 g過(guò)硫酸銨、2.26 g檸檬酸氫二銨、0.90 g二羥丙酮溶于10 mL去離子水中,分別吸取銨鹽溶液與二羥丙酮溶液0.75 mL混合置于帶塞試管中,在25 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過(guò)濾,檢測(cè)APZ含量。

1.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)烷基吡嗪的影響

1.2.2.1 不同反應(yīng)時(shí)間的影響 分別將0.53 g氯化銨、0.90 g二羥丙酮溶于10 mL去離子水中,分別吸取銨鹽溶液與二羥丙酮溶液0.75 mL于25 ℃室溫下混合,用0.22 μm孔徑的濾頭過(guò)濾,檢測(cè)24 h內(nèi)(含24 h)APZ含量,每3 h進(jìn)樣一次。

1.2.2.2 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的建立 零級(jí)反應(yīng)是指反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的零次方成正比(即與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān))的化學(xué)反應(yīng)。即反應(yīng)級(jí)數(shù)為零的化學(xué)反應(yīng)。

零級(jí)反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)時(shí)間滿足:[A]t=[A]0-K0t線性關(guān)系

式中,[A]t:反應(yīng)時(shí)間為t時(shí)的反應(yīng)產(chǎn)物;[A]0:反應(yīng)時(shí)間為0時(shí)的反應(yīng)產(chǎn)物;-K0:斜率;t:反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)烷基吡嗪的影響 分別將0.53 g氯化銨、0.90 g二羥丙酮溶于10 mL去離子水中,分別吸取銨鹽溶液與二羥丙酮溶液0.75 mL混合置于帶塞試管中,置于溫度為25、35、45、55、65、75、85、95 ℃的水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過(guò)濾,檢測(cè)APZ含量。

1.2.4 反應(yīng)底物濃度與比例對(duì)烷基吡嗪的影響 二羥丙酮與氯化銨的濃度比為1∶1,分別配制濃度為0.5、1.3、2.1、2.9、3.3、4.1、4.5、5.3 mol/L的二羥丙酮氯化銨反應(yīng)溶液,在95 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過(guò)濾,檢測(cè)烷基吡嗪含量。固定二羥丙酮濃度為3.7 mol/L,按0.25∶1、0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶7、1.75∶1、2∶1比例配制氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)溶液。在95 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過(guò)濾,檢測(cè)APZ含量。

1.2.5 反應(yīng)pH對(duì)烷基吡嗪的影響 用0.1 mol/L鹽酸溶液與0.1 mol/L氫氧化鈉溶液分別配制pH為3、4、5、6、7、8、9的去離子水溶液10 mL,取0.50 g二羥丙酮溶于1.5 mL不同pH水溶液中,再分別加入0.29 g氯化銨,在95 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過(guò)濾,檢測(cè)APZ含量。

1.2.6 烷基吡嗪含量的測(cè)定 參考陳繼承等[17]的方法,略有改進(jìn)。色譜條件:Waters C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm),進(jìn)樣體積10 μL,流動(dòng)相A:乙腈,流動(dòng)相B:含1%甲酸、1%三氟乙酸(V/V)的水溶液,檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm,柱溫40 ℃,進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

表2 不同銨鹽與二羥丙酮反應(yīng)生成的APZ種類及含量(占吡嗪總量百分比)Table 2 The types and content of APZ produced by different ammonium salts in reactionwith dihydroxyacetone(accounted for the percentage of total pyrazine)

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS軟件(SPSS 25.0 for windows,SPSS Inc,Chicago,IL,USA),采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行“Tukey”差異分析。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

為了便于結(jié)果的討論,現(xiàn)將文中檢測(cè)的10種烷基吡嗪進(jìn)行大致的歸類。吡嗪環(huán)(Pyr):吡嗪;一甲基吡嗪(MP):2-甲基吡嗪;二甲基吡嗪(DMP):2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪;三甲基吡嗪(TriMP):2,3,5-三甲基吡嗪;四甲基吡嗪(TMP):2,3,5,6-四甲基吡嗪;乙基吡嗪(EP):2-乙基吡嗪;乙基-甲基吡嗪(EP-MP):2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)甲基吡嗪。

2.1 銨鹽對(duì)烷基吡嗪的影響

經(jīng)檢測(cè),五種銨鹽底物與二羥丙酮反應(yīng)皆生成了相應(yīng)種類的APZ。由表2可以看出,在五種銨鹽底物中,與二羥丙酮反應(yīng)生成APZ含量由高到低的排序是氯化銨>硫酸銨>檸檬酸氫二銨>乙酸銨>過(guò)硫酸銨,氯化銨所對(duì)應(yīng)的APZ總含量最高,達(dá)到(4.59±0.11) mg/L。氯化銨、檸檬酸氫二銨的反應(yīng)中產(chǎn)生了10種烷基吡嗪,乙酸銨和硫酸銨則包含了8種,過(guò)硫酸銨最少,為6種。相比陳詩(shī)佳等[18]和趙洪源等[19]通過(guò)培育高產(chǎn)乙偶姻菌株以生成四甲基吡嗪的方法,本研究中二羥丙酮與銨鹽的反應(yīng)生成APZ顯示了更多可能性,且操作更加簡(jiǎn)單,耗時(shí)短。乙酸銨、氯化銨、硫酸銨、過(guò)硫酸銨這四種銨鹽的吡嗪產(chǎn)物中,無(wú)支鏈的吡嗪環(huán)均是占比最高的,尤其是過(guò)硫酸銨,比例高達(dá)78.04%。

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)烷基吡嗪的影響

由表3可知,在氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)體系中,在反應(yīng)的初級(jí)階段即0～3 h內(nèi),反應(yīng)速率上升較快,APZ生成量快速上升;在3～15 h內(nèi),APZ生成量持續(xù)增大,但增速減緩,在第15 h達(dá)到最高,為(6314.53±75.70) μg/L;在15～24 h,隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),APZ生成量呈上下波動(dòng)的狀態(tài)。在化學(xué)反應(yīng)前期,反應(yīng)速率較快,10種APZ生成量都隨著反應(yīng)時(shí)間的增大而增大;在反應(yīng)的中后期,由于達(dá)到化學(xué)平衡以及反應(yīng)底物濃度的降低和逆反應(yīng)的發(fā)生[20]。10種APZ中MP、DMP的含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而下降;Pyr、EP含量則是增長(zhǎng)到最高值后,有所下降并逐漸平穩(wěn)。由圖1可知,TriMP和TMP的生成量與時(shí)間基本呈線性關(guān)系,時(shí)間動(dòng)力學(xué)擬合方程均為Y=aX+b形式,遵循零級(jí)反應(yīng),反應(yīng)速率與反應(yīng)濃度無(wú)關(guān),生成量始終隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增加。TriMP的時(shí)間動(dòng)力學(xué)擬合方程為Y=8.7896X+174.33,斜率為8.7896;TMP的時(shí)間動(dòng)力學(xué)擬合方程為Y=4.0722X+1192.6,斜率為4.0722,且判定系數(shù)(coefficient of determination,R2)均在0.85以上,說(shuō)明該方程擬合程度較好,在Huang等[21-22]的文章中,證實(shí)了在氨基酸-葡萄糖體系中,TriMP與TMP的生成遵循零級(jí)反應(yīng),此結(jié)果與文中相符。

圖1 氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)24 hTriMP、TMP生成量的時(shí)間動(dòng)力學(xué)Fig.1 Time kinetics of production of TriMP and TMP in 24 hreaction between ammonium chloride and dihydroxyacetone 注:TriMP:2,3,5-三甲基吡嗪;TMP:四甲基吡嗪。

表3 不同反應(yīng)時(shí)間下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 3 The content of alkyl pyrazine was changed by the reaction ofammonium chloride and dihydroxyacetone at different reaction times

表4 在不同溫度下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 4 The content of alkyl pyrazine was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different temperature

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)烷基吡嗪的影響

由表4可知,APZ生成量隨反應(yīng)溫度的升高而升高,APZ生成量在95 ℃處最高,為(3.41×104±148.20) mg/L,與85 ℃時(shí)為(1.52×104±145.60) mg/L存在差異性顯著(P<0.05),說(shuō)明當(dāng)溫度到達(dá)一定數(shù)值時(shí),氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)APZ生成量能夠顯著升高。從10種APZ含量隨反應(yīng)溫度變化的顯著性分析可以看出,相較于另八種APZ,TriMP與TMP在更低的溫度即出現(xiàn)顯著性差異,分別是55與65 ℃。唐樂攀等[23]研究結(jié)果表明:在抗壞血酸-半胱氨酸體系美拉德反應(yīng)中,生成的吡嗪大部分是甲基吡嗪,在反應(yīng)溫度升高時(shí)甲基吡嗪含量隨之提升;以糖、氨和氨基酸為底物,探究了反應(yīng)溫度對(duì)APZ生成的影響[24],結(jié)果顯示APZ的收率隨著溫度的升高而升高。本文結(jié)果與此相符,且以二羥丙酮與銨鹽作為底物反應(yīng)生成烷基吡嗪,對(duì)溫度的要求更低,且生成的APZ的種類更加豐富。

表5 在不同濃度下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table5 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different concentrations

2.4 反應(yīng)濃度及比例對(duì)烷基吡嗪的影響

由表5可知,隨著反應(yīng)底物濃度的升高,除了EP與E-5(6)-MP含量是呈上升趨勢(shì)外,其余8種APZ的含量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。其中,包括Pyr、MP、TriMP、TMP以及2,3-DMP含量均是在反應(yīng)底物濃度3.7 mol/L時(shí)最高,2,5-DMP、2,6-DMP與E-3-MP的含量則是在反應(yīng)底物濃度為4.5 mol/L時(shí)最高。APZ生成量在反應(yīng)底物濃度為3.7 mol/L時(shí)最高,為(6375.56±139.17) mg/L。并且,在底物濃度2.1～3.7 mol/L之間,APZ的生成量呈現(xiàn)顯著上升,并具有顯著差異(P<0.05),最高值比2.1 mol/L處含量增加了339.29%,底物濃度為5.3 mol/L時(shí),與最高值相比APZ生成量下降了30.22%。反應(yīng)底物濃度對(duì)APZ的生成起促進(jìn)作用,之后含量下降猜測(cè)也許是因?yàn)榈孜餄舛仍黾铀只疃认陆挡焕诜磻?yīng)進(jìn)行的原因[25]。

反應(yīng)底物比例對(duì)反應(yīng)生成APZ含量的影響見表6。除了E-5(6)-MP含量,其他APZ含量的趨勢(shì)均是先上升后下降。Pyr、TriMP、TMP、2,3-DMP、EP均是在氯化銨與二羥丙酮濃度比例為1∶1時(shí)最高;MP在比例為0.75∶1時(shí)含量最高;2,6-DMP在比例為1.25∶1時(shí)含量最高;2,5-DMP、E-3-MP在比例為1.5∶1時(shí)含量最高?？傮wAPZ生成量在底物比例為1∶1時(shí)最高?？梢钥闯雎然@與二羥丙酮反應(yīng),二羥丙酮作為碳源,主要是氯化銨轉(zhuǎn)化二羥丙酮生成APZ,當(dāng)氯化銨比例過(guò)低時(shí)或過(guò)高時(shí),均不利于APZ的生成,由于二羥丙酮的濃度固定為3.7 mol/L,所以當(dāng)氯化銨比例過(guò)高時(shí),APZ生成量降低還有部分原因是因?yàn)樗只疃认陆祵?dǎo)致溶解度降低不利于反應(yīng)的進(jìn)行。

表6 在不同濃度比例下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 6 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction ofammonium chloride and dihydroxyacetone at different Concentration ratio

表7 在不同pH下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 7 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different pH

2.5 不同pH對(duì)烷基吡嗪的影響

在二羥丙酮-銨鹽體系中,APZ生成量在pH為3時(shí)最高,為(5921.33±136.55) mg/L,最低點(diǎn)在pH為9時(shí),為(5417.36±125.95) mg/L,由表7可以看出,pH對(duì)10種APZ的影響各不相同,Pyr生成量隨著反應(yīng)pH的增大而減小,其余APZ的生成量皆是隨著pH的增大之后上下浮動(dòng)。其中Pyr、DMP含量的最高點(diǎn)是在pH為3時(shí);E-3-MP含量的最高點(diǎn)在pH為4時(shí);MP、TriMP的最高點(diǎn)在pH為9時(shí);TMP、EP、E-5(6)-MP含量的最高點(diǎn)在pH為8時(shí)?？梢钥闯鲈谄嵝缘沫h(huán)境下能促進(jìn)Pyr、DMP、E-3-MP的生成;在偏堿性的環(huán)境下能促進(jìn)MP、TriMP、TMP、EP、E-5(6)-MP的生成。從表7可以看出隨著pH的變化,TriMP、TMP、E-3-MP含量有變化,但是都沒有顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明pH的變化對(duì)這三種APZ無(wú)顯著影響。在不同的反應(yīng)體系中pH對(duì)吡嗪生成的影響各不相同,余自琳等[26]關(guān)于墨魚酶解物的美拉德反應(yīng)研究中,反應(yīng)pH范圍在5～10時(shí),TriMP、2,5-DMP、MP含量隨著pH增大而升高。而在 Huang等[22]的研究中,pH對(duì)TMP形成的影響則與本文相反?？梢姺磻?yīng)模型體系的不同,反應(yīng)條件對(duì)所生成吡嗪的影響可能呈相反的效果。

3 結(jié)論

在二羥丙酮-銨鹽體系中,氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成的APZ種類與含量最高。在24 h內(nèi)的反應(yīng)時(shí)間下,APZ生成量在第15 h時(shí)最高,為(6314.53±75.70) mg/L,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降,其中TriMP與TMP的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)遵循零級(jí)反應(yīng)。溫度對(duì)APZ的生成起促進(jìn)作用,APZ的生成量隨著溫度的升高而升高。氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)的最佳濃度為3.7 mol/L,APZ生成量隨著反應(yīng)濃度的升高先上升后下降;反應(yīng)最佳比例為1∶1,在固定二羥丙酮濃度的情況下,隨著氯化銨濃度比例的升高APZ生成量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì);在pH為3時(shí),二羥丙酮與氯化銨反應(yīng)APZ生成量最高,為(5921.33±136.55) mg/L,隨著pH的增大,APZ生成量下降并上下浮動(dòng)。由于加熱方法采用水浴,本文只探討了在100 ℃以下的烷基吡嗪生成規(guī)律,在后期的研究中,將更換加熱方法,進(jìn)行100 ℃以上的研究。本文采用銨鹽與二羥丙酮為底物,展示了此模型體系中APZ產(chǎn)物的豐富性,且對(duì)于不同的APZ,反應(yīng)條件的影響也不盡相同,其中的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。