QuEChERSUPLCMS/MS測(cè)定火鍋湯料中6種非法添加化學(xué)藥物

劉 俊,吳愛(ài)紅,朱 呂,張孝艷,厲晨皓,徐秋生

(平湖市食品藥品檢測(cè)中心,浙江嘉興 314200)

火鍋?zhàn)鳛橐环N傳統(tǒng)中國(guó)美食,在全國(guó)范圍內(nèi)廣受歡迎,深受大眾喜愛(ài)。正因如此,部分商家為了吸引回頭客,謀取私利,使得火鍋湯料成為非法添加的重災(zāi)區(qū)?；疱仠系姆欠ㄌ砑又饕ɡ浰跉ど飰A、工業(yè)著色染料和頭痛粉三大類[1]。近年來(lái),文獻(xiàn)中很多關(guān)于火鍋湯料中罌粟殼生物堿和工業(yè)著色染料的測(cè)定方法的報(bào)道[2-3],2018年4月國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布的《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測(cè)定》食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法,闡明了火鍋湯料中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的定量測(cè)定。頭痛粉為阿咖酚散的俗稱,是一種解熱鎮(zhèn)痛化學(xué)藥品。添加到火鍋湯料中是為了增味提鮮及防治消費(fèi)者餐后出現(xiàn)腹瀉等身體不適狀況。常用的此類解熱鎮(zhèn)痛類藥物包括對(duì)乙酰氨基酚(paracetamol)、氯苯那敏(chlorpheniramine maleate)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、阿司匹林(aspirin)、氨基比林(aminophenazone)和安替比林(antipyrine)等。消費(fèi)者長(zhǎng)期食用含有該類化學(xué)藥物的食品會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)或引起急性肝臟、腎臟毒性,嚴(yán)重甚至?xí)斐蓚€(gè)體死亡[4-7]。

目前,對(duì)乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林和安替比林檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]和液相色譜-質(zhì)譜法等[12-13]。這些方法多以單一組分進(jìn)行檢測(cè)且樣品基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單,多為血漿、保健品或涼茶等[14-18]。火鍋湯料等高脂肪、高蛋白復(fù)雜基質(zhì)中對(duì)乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林和安替比林檢測(cè)方法少有報(bào)道,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)暫未發(fā)布權(quán)威的檢測(cè)方法。因此有必要建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)火鍋湯料中多種非法添加的化學(xué)藥物進(jìn)行篩查。

分散固相萃取技術(shù)QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)是一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確將目標(biāo)組分提取與進(jìn)化的前處理方法[19],已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蔬菜水果和肉類中農(nóng)藥、獸藥多殘留的檢測(cè)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)火鍋湯料進(jìn)行QuEChERS提取和凈化,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)建立火鍋湯料中對(duì)乙酰氨基酚等6種非法添加化學(xué)藥物的分析檢測(cè),該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6種化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)品:對(duì)乙酰氨基酚(純度99.9%)、馬來(lái)酸氯苯那敏(純度99.5%)、雙氯芬酸鈉(純度99.2%)、阿司匹林(純度99.8%)、氨基比林(純度99.5%)和安替比林(純度99.9%) 均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈 色譜純,美國(guó)賽默飛世爾公司;無(wú)水硫酸鎂、乙酸鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化鋁和佛羅里硅土(Florisil) 深圳逗點(diǎn)生物;超純水 實(shí)驗(yàn)室制備;0.22 μm有機(jī)微孔濾膜 天津美瑞泰克科技有限公司;30批次火鍋湯料樣品 平湖市8個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道(當(dāng)湖街道、鐘埭街道、新倉(cāng)鎮(zhèn)各5批次,曹橋街道、獨(dú)山港鎮(zhèn)、新埭鎮(zhèn)、廣陳鎮(zhèn)、林埭鎮(zhèn)各3批次)。

Waters Xevo TQ-S高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)沃特世公司;高速均質(zhì)器、渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司;H1850R高速離心機(jī) 湖南湘儀;MS204S電子天平 METTLER TOLEDO(上海)有限公司;Milli-Q Advatantage A10純水儀系統(tǒng) 法國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取對(duì)乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林、安替比林6種化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃避光儲(chǔ)存。分別吸取0.5 mL對(duì)乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、氨基比林、安替比林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和5.0 mL阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成5.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(阿司匹林濃度為50.0 μg/mL)。再用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋至1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(阿司匹林濃度為10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0 ng/mL)。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Waters C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動(dòng)相A:乙腈;流動(dòng)相B:0.1%甲酸水;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;柱溫:40 ℃。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program

1.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,正離子和負(fù)離子掃描(ESI+/ESI-);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源溫度:150 ℃;脫溶劑溫度:450 ℃;脫溶劑氮?dú)饬魉?1000 L/h;毛細(xì)管電壓:3 kV。在電噴霧模式下分別對(duì)0.5 mg/L、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描,通過(guò)優(yōu)化離子源、離子管溫度和輔助氣流量等參數(shù)使母離子響應(yīng)達(dá)到最優(yōu)值,并優(yōu)化得到每個(gè)化學(xué)藥物的母離子和子離子最佳錐孔電壓和碰撞能量,以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行掃描,選擇離子信號(hào)前兩位分別作為定性或定量離子。具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 6種化學(xué)藥物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 2 Parameters for mass spectrometric analysis of the 6 chemical drugs

1.2.4 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取2.00 g火鍋湯料樣品于50 mL離心管中,加入2.5 mL水,渦旋均勻試樣,加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液,渦旋2 min,超聲提取10 min。加入3 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉,渦旋2 min,5000 r/min離心5 min。將上述上清液移取1.0 mL于裝有150 mg MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB的離心管中,渦旋混合1 min,8000 r/min離心5 min,上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Waters Xevo TQ-S高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀Masslynx軟件分析處理,坐標(biāo)圖標(biāo)采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)分析,質(zhì)譜圖采用Photoshop軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 甲醇和乙腈都是化學(xué)藥物檢測(cè)中常用的提取溶劑,但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用甲醇提取時(shí),加入鹽后無(wú)法與水相分層,而乙腈加鹽后能較好分層且在下一步凈化時(shí)不需要進(jìn)行轉(zhuǎn)換溶劑,可簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟。另外,在化學(xué)藥物提取時(shí)加入適量的酸既能夠防止部分藥物在堿性條件下發(fā)生降解又能更好地去除雜質(zhì)[22],本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈和0.1%甲酸-乙腈兩種提取溶劑的效果,如圖1所示,用0.1%甲酸-乙腈作為提取溶劑時(shí),對(duì)乙酰氨基酚、氨基比林和安替比林的回收率明顯提高。因此本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸-乙腈體系進(jìn)行提取。

圖1 不同提取溶劑對(duì)6種化學(xué)藥物質(zhì)提取效果Fig.1 Extraction efficiencies of 6 chemicaldrugs with different solutions注:A為0.1%甲酸乙腈,B為乙腈。

2.1.2 凈化吸附劑的優(yōu)化 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化鋁和佛羅里硅土(Florisil)等是QuEChERS方法中常用的凈化吸附劑。為考察不同凈化劑對(duì)6種化學(xué)藥物的吸附效果,移取1.0 mL濃度為50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入裝有100 mg PSA、C18、GCB、中性氧化鋁和Florisil離心管中,渦旋1 min,8000 r/min離心5 min,上清液過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。由圖2可見(jiàn),PSA、C18和GCB 3種凈化吸附劑對(duì)6種化學(xué)藥物的吸附性不大,均有較好的回收率。而中性氧化鋁和佛羅里硅土除了對(duì)氨基比林和安替比林吸附性不大外,對(duì)對(duì)乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉和阿司匹林均具有較強(qiáng)的吸附性,因此,選擇PSA、C18和GCB 3種凈化吸附劑進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同凈化劑對(duì)6種化學(xué)藥物質(zhì)回收率影響Fig.2 Effects of different sorbents on therecoveries of the 6 chemical drugs

凈化吸附劑的使用量對(duì)待測(cè)物回收率也會(huì)有較大影響,因此本實(shí)驗(yàn)稱取2.0 g已知空白火鍋湯料樣品,加入100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液使檢測(cè)終濃度為50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL),然后按照1.2.4方法進(jìn)行前處理。移取1.0 mL前處理上清分別加入裝有不同質(zhì)量 PSA、C18和GCB離心管中,渦旋混合1 min,8000 r/min離心5 min,上清液過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果如圖3～圖5所示,分別用質(zhì)量為100 mg的PSA和C18作為凈化吸附劑時(shí),6種化學(xué)藥物的回收率均大于80%;用GBC作為凈化吸附劑時(shí)最佳用量為50 mg,加大用量會(huì)降低6種化學(xué)藥物的回收率。因此,本方法最終采用100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB的組合方案進(jìn)行凈化。

圖3 PSA加入量對(duì)6種化學(xué)藥物質(zhì)回收率影響Fig.3 Effects of PSA dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

圖4 C18加入量對(duì)6種化學(xué)藥物質(zhì)回收率影響Fig.4 Effects of C18 dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

圖5 GCB加入量對(duì)6種化學(xué)藥物質(zhì)回收率影響Fig.5 Effects of GCB dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

2.2 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別采用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水和乙腈-甲酸銨水5種流動(dòng)相體系。通過(guò)對(duì)分離效果的綜合評(píng)價(jià),采用甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí),6種化學(xué)藥物的響應(yīng)值高,分離度、峰形好,6種化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6。為進(jìn)一步確定流動(dòng)相中最適的甲酸濃度,本實(shí)驗(yàn)研究了50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在甲酸體積分?jǐn)?shù)在0.01%～0.5%之間時(shí)各組分響應(yīng)值的變化情況,具體結(jié)果見(jiàn)圖7,縱坐標(biāo)為甲酸體積分?jǐn)?shù)下的響應(yīng)值與最大響應(yīng)值的比值。結(jié)果表明,甲酸體積分?jǐn)?shù)在0.01%～0.1%之間時(shí),大多數(shù)組分響應(yīng)值隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增加而增強(qiáng),甲酸體積分?jǐn)?shù)超過(guò)0.1%后,6種化學(xué)藥物響應(yīng)值均有所降低。本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相。

圖6 6種化學(xué)藥物質(zhì)譜圖Fig.6 Mass chromatogram of the 6 chemical drugs

圖7 流動(dòng)相中甲酸濃度對(duì)6種化學(xué)藥物響應(yīng)值的影響Fig.7 Effects of formic acid solubility on the6 chemical drugs value in mobile phase

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在1.2.2和1.2.3中確定的色譜條件和質(zhì)譜條件下,取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用流動(dòng)相配制1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL(阿司匹林為10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0 ng/mL)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定,以各化學(xué)藥物的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),定量離子的響應(yīng)值峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到各化學(xué)藥物的線性方程。如表3所示,6種化學(xué)藥物的線性決定系數(shù)均大于0.99,表明各組分在1.0～200.0 ng/mL(阿司匹林10.0～2000.0 ng/mL)濃度范圍內(nèi)均具有良好線性關(guān)系。在空白的火鍋湯料樣品中添加適量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2.4進(jìn)行樣品前處理后質(zhì)譜分析,以3倍信噪比(S/N)計(jì)算儀器檢出限(LOD),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 6種化學(xué)藥物的線性方程、決定系數(shù)和檢出限Table 3 Standard curve,linear correlation and limits of detection of the 6 chemical drugs

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

表4 6種化學(xué)藥物的平均回收率和精密度(n=6)Table 4 Average recoveries and precisions(RSDs)of the 6 chemical drugs(n=6)

稱取2.00 g均質(zhì)好的火鍋湯料空白樣品若干份,分別添加5.0、50.0、500.0 μg/kg(阿司匹林為50.0、500.0、5000.0 μg/kg)3個(gè)梯度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,樣品前處理后進(jìn)行質(zhì)譜分析,平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和精密度。如表4所示,各化學(xué)藥物的回收率介于72.1%～114.8%,精密度(RSD)為0.81%～14.6%,表明本檢測(cè)方法準(zhǔn)確度好和精密度高,可滿足實(shí)驗(yàn)室日常分析檢測(cè)需求。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本研究建立的檢測(cè)方法分別對(duì)本市經(jīng)營(yíng)餐飲單位的30個(gè)火鍋湯料進(jìn)行6種非法添加化學(xué)藥物殘留量的檢測(cè),結(jié)果顯示,在所檢的30個(gè)批次的樣品中有1個(gè)批次檢出對(duì)乙酰氨基酚和阿司匹林,后經(jīng)執(zhí)法部門跟進(jìn)調(diào)查,該餐飲店承認(rèn)其在火鍋湯料中添加了含有對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林和咖啡因成分的阿咖酚散(俗稱頭痛粉)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將QuEChERS前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于火鍋湯料中6種非法添加化學(xué)藥物對(duì)乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林和安替比林的檢測(cè),通過(guò)對(duì)QuEChERS前處理方法和色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化,建立了定性、定量測(cè)定火鍋湯料中6種非法添加化學(xué)藥物殘留量的檢測(cè)方法。該方法前處理操作簡(jiǎn)便,對(duì)火鍋湯料基質(zhì)凈化效果好,在1.0～200 ng/mL(阿司匹林10.0～2000 ng/mL)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),6種非法添加化學(xué)藥物的線性決定系數(shù)均大于0.99,該方法的檢出限在0.05～1.0 μg/kg之間,加標(biāo)回收率為72.1%～114.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～14.6%。該方法可用于火鍋湯料中非法添加化學(xué)藥物的快速篩查,為打擊火鍋湯料中非法添加行為提供有力依據(jù),保證消費(fèi)者的合法利益。