烏龍茶加工過程中α法呢烯的形成關鍵調(diào)控基因的篩選與表達分析

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(1.福建農(nóng)林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室,福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所,福建福州 350002)

α-法呢烯(C15H24)是最簡單的非環(huán)狀倍半萜類次生代謝物質(zhì)[1](圖1)。作為植物中具揮發(fā)性的花果香成分[2],在誘導昆蟲產(chǎn)卵[3]、植物防御[4]、生長調(diào)控[5]等方面具有重要作用。α-法呢烯合成酶(AFS)屬于2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑(MEP途徑)和甲羥戊酸途徑(MVA途徑)的下游限速酶[6],直接參與了α-法呢烯的后期合成?，F(xiàn)代科學對于α-法呢烯的研究與應用已經(jīng)深入食品工業(yè)、醫(yī)療工業(yè)等領域[7]。

圖1 α-法呢烯化學結構式Fig.1 Chemical structure of α-farnesene

茶樹鮮葉經(jīng)萎凋、做青、殺青等加工工藝,促使香氣物質(zhì)前體發(fā)生一系列水解和轉化[8],從而形成了烏龍茶天然花果香的品質(zhì)特點。α-法呢烯是烏龍茶成茶重要賦香物質(zhì)之一,在烏龍茶中呈花果香[9]。與果樹[10-11]、煙草[12]等植物中α-法呢烯代謝不同,茶樹葉片在遭受脅迫時會釋放α-法呢烯作為響應。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn),蟲咬等生物脅迫促使茶樹釋放茉莉酸,誘導CsAFS基因上調(diào)表達,促使α-法呢烯的合成釋放;同時,α-法呢烯可充當信號因子傳遞給其它未受生物脅迫的茶樹,有助于研究茶樹抵抗環(huán)境脅迫及茶樹植物應激激素的釋放。在茶葉采摘離體后,茶葉加工過程中所施加的外源脅迫因子,如失水可明顯改變做青葉的香氣組成模式,α-法呢烯等物質(zhì)含量逐漸增多[14];機械力反復作用下的搖青葉形成豐富的香氣物質(zhì),有助于形成烏龍茶的花果香[15-16];光照[17-18]、溫度[19-20]激活了葉片中的MEP和MVA途徑。香氣是烏龍茶品質(zhì)的核心因素之一[21]。前人的研究中,多是研究烏龍茶的香氣組成及比較不同品種烏龍茶的賦香物質(zhì),如黃福平等[22]認為與肉桂茶品質(zhì)密切相關的特征性香氣組分主要有橙花叔醇、己酸己烯酯、α-法呢烯、芳樟醇等;陳榮冰等[23]對比黃旦與瑞香的香氣差異,認為兩種烏龍茶各自的品種香主要是因為橙花叔醇、香葉醇、α-法呢烯等物質(zhì)的含量存在差異。亦有研究比較不同工藝處理下的同一品種烏龍茶的香氣組分,如陳林等[24]通過調(diào)控鐵觀音制作工藝,調(diào)控烏龍茶做青與烘干工序,做成不同風味的鐵觀音,利用鐵觀音新茶與陳茶香氣組成的化學模式的差異,提出橙花叔醇、α-法呢烯、吲哚等物質(zhì)可以作為區(qū)分鐵觀音新茶和陳茶的主要特征香氣成分。然而,結合茶樹次生代謝途徑,就某單一的特征香氣形成和變化的研究,卻不多見。

萜類化合物是植物的次生代謝物[25],伴隨著茶樹生長與茶葉采摘加工過程中的生物脅迫誘導子和非生物誘導子會影響次生代謝物的產(chǎn)生[26]。陳壽松等[27]認為,烏龍茶中的倍半萜類,如橙花叔醇、α-法呢烯呈現(xiàn)宜人的花果香,其香味閾值對烏龍茶的風味形成貢獻很大。本研究以烏龍茶鮮葉、萎凋葉、做青過程葉為研究試材,通過檢測樣品中α-法呢烯的相對含量,計算基于轉錄組數(shù)據(jù)篩選出α-法呢烯合成酶關鍵基因并驗證其相對表達水平,分析研究烏龍茶加工過程中α-法呢烯合成的分子機制,以期為今后研究烏龍茶花果香的形成提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃旦品種春季1芽3葉 無病蟲害，采摘于福建農(nóng)林大學茶學教學科研實踐基地茶樹資源圃;RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;PremeScriPtTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

6CYQT-60型搖青機、LGJ-25C 型真空冷凍干燥機 北京四環(huán)生物制藥有限公司;7890B氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;MPS 多功能自動進樣系統(tǒng) 德國格斯特爾公司;Pegasus HT 飛行時間質(zhì)譜 美國力可公司;Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司;K5500 超微量分光光度計 北京凱奧公司;LightCycler 480實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀 美國羅氏公司;萃取針PDMS/DVB9(23 Ga,Plain,65 μm) 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗處理及分組 樣品于2018年10月1日下午3～5時采集,采摘標準為一芽三葉,要求老嫩程度均一且無病蟲害的黃旦鮮葉(F),鮮葉采摘后進行30 min萎凋,獲得萎凋葉(SW)。萎凋后的做青加工先后有三次,搖青機速度控制在25 r/min,搖青時間控制在5 min,每次搖青后進行60 min的晾青。分別在三次搖青階段結束后采集500 g樣品,標注為T1、T2、T3,作為實驗組(EG)。在采集實驗組樣品的同時,分別取同一時間段的未經(jīng)做青工序的萎凋葉樣品各500 g,標注為CK1、CK2、CK3,作為對照組。以上每個取樣設3個重復。所有樣品用錫箔紙包好后,快速放入液氮后取出,于-70 ℃冷藏。

1.2.2 香氣檢測 稱取2.0 g茶葉粉末于20 mL頂空瓶,蓋好后利用頂空固相微萃取法(HS-SPME)提取揮發(fā)性物質(zhì),并用氣相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(GC-TOF-MS)進行檢測。SPME:萃取針PDMS/DVB9設定孵育溫度為80 ℃,孵育時間為31 min,萃取時間為60 min,解析時間為3.5 min。色譜條件:色譜柱Rxi?-5silMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。進樣口溫度控制在250 ℃,傳輸線溫度設定為275 ℃,以氦氣為載氣,設置氦氣流速為1 mL/min;程序升溫過程為50 ℃保持5 min,以3 ℃/min的速率升至210 ℃并保持3 min,此后再以15 ℃/min的速率升至230 ℃;不分流進樣品。質(zhì)譜條件:溶劑延遲時間設定為300 s,掃描范圍控制在30～500 amu,采集速率為10 Spec/s;檢測器電壓為1530 V,EI電離能量為70 eV,離子源溫度為250 ℃。

測得揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)由儀器自帶軟件進行分析處理,與美國國家標準技術局化學(The National Institute of Standards and Technology,NIST)數(shù)據(jù)庫標準質(zhì)譜進行比較,查對有關質(zhì)譜資料,對基峰、質(zhì)核比和相對峰度等方面進行分析,結合保留時間和質(zhì)譜分別對各峰加以確認,從中鑒定出了α-法呢烯組分,將峰面積>1%的色譜峰作為有效觀測值,以峰面積歸一化法確定α-法呢烯組分在各樣品中的百分含量[28-30]。

表1 qRT-PCR特異性引物Table 1 The specific primers for qRT-PCR

1.2.3 茶樹全基因組的來源 基于茶樹全基因組數(shù)據(jù)庫Tea Plant Information Archive(TPIA,http://tpia. teaplant.org/),在KEGG代謝通路中的倍半萜及三萜生物合成(#00909)中獲得11條α-法呢烯合成相關基因(圖2)。

圖2 KEGG代謝通路中編碼α-法呢烯合成酶基因家族成員Fig.2 KEGG pathway of CsAFS gene family members

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建 對篩選獲得的CsAFS基因家族成員的核酸序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行對比,獲得其他植物物種的同源序列,使用Mega7.0以鄰接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹另存為NWK文檔,利用iTOL網(wǎng)站(http://itol.embl.de/)對系統(tǒng)發(fā)育樹進行可視化處理。

1.2.5 總RNA的提取與cDNA的合成 參照RNAprep Pure Plant Kit說明以離心柱法抽提1.2.1中鮮葉、萎凋葉及實驗組、對照組的茶樹葉片加工過程中的總RNA,利用超微量核酸分析儀檢測其濃度和純度,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉錄合成cDNA,將獲得的cDNA文庫置于-20 ℃條件下貯藏備用。

1.2.6 qRT-PCR檢測 采用SYBR@Premix Ex TaqTM試劑盒對黃旦葉片的CsAFS7基因表達情況進行檢測。利用DNAman設計目的基因的特異性引物如表1所示。以CsGADPH為內(nèi)參基因。反應體系20.0 μL:SYBR Green Master Mix 10.0 μL,正、反向引物各0.8 μL,滅菌水7.4 μL,cDNA模板1.0 μL。擴增程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt分別計算出相關基因的相對表達量[31]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 6.0 和 SPSS 20對試驗數(shù)據(jù)進行分析及制圖,分別利用ANOVA并圖基(Tukey)法和獨立樣本t檢驗衡量實驗組與對照組中α-法呢烯含量及CsAFS相關基因表達水平的組內(nèi)差異和組間差異的顯著性;利用皮爾遜相關系數(shù)評估α-法呢烯含量CsAFS基因的表達水平的相關性。

2 結果與分析

2.1 烏龍茶加工過程α-法呢烯的鑒定及其動態(tài)變化規(guī)律

通過頂空固相微萃取法(HS-SPME)結合氣相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(GC-TOF-MS)技術,進行烏龍茶香氣檢測,各樣品的總離子流圖如圖3所示。基于NIST數(shù)據(jù)譜庫鑒定出α-法呢烯組分的離子峰(R.T.=2157.7),如圖4所示,結果發(fā)現(xiàn),從鮮葉(F)到第三次搖青葉(T3)α-法呢烯的組分相對含量整體呈現(xiàn)上升趨勢,在T3時含量達到最高值0.9485%。在實驗組中,由于搖青工藝的開始,T1中所測得的α-法呢烯的組分相對含量為0.2465%,低于SW所測得的α-法呢烯的組分相對含量0.3916%,這表明搖青機械力的介入降低了樣品茶葉的α-法呢烯的含量。但是隨著加工工藝的推進,搖青所帶來的機械脅迫可以提高茶葉中的α-法呢烯的含量。對比實驗組中三次搖青之間的α-法呢烯的組分相對含量,可得三個數(shù)值之間存在明顯差異,T1所測得的數(shù)值約為T2所測得的數(shù)值的40%,T2所測得的數(shù)值約為T3所測得數(shù)據(jù)的70%。對照組的α-法呢烯的組分相對含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,伴隨著茶葉自身水分的逸失,α-法呢烯的組分相對含量在CK3處達到攤晾過程中的最高值,數(shù)值為0.4273%。實驗組和對照組對比中,T1和CK1存在差異,T2和CK2、T3和CK3組間存在極顯著差異(P<0.01)。這說明,隨著茶鮮葉的失水及機械脅迫的累加,茶葉中α-法呢烯的含量逐漸增加,成為影響烏龍茶成茶香氣的重要成分。

圖3 烏龍茶加工過程樣的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion flow chromatogram of oolong tea processing samples注:箭頭表示基于NIST數(shù)據(jù)譜庫鑒定出的α-法呢烯的離子峰。

圖4 烏龍茶加工過程中α-法呢烯組分相對含量的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of α-Farnesene contentin different oolong tea manufacturing process注:F表示鮮葉;SW表示萎凋葉;T1表示第一次搖青葉;T2表示第二次搖青葉;T3表示代表第三次搖青葉。

圖柱上不同小寫字母表示不同時間點的表達量存在顯著差異(P<0.05),大寫字母表示不同時間點的表達量存在極顯著差異(P<0.01),*表示實驗組和對照組間獨立樣本t檢驗存在顯著性差異(P<0.05),**表示實驗組和對照組間獨立樣本t檢驗存在極顯著性差異(P<0.01)；圖7同。

2.2 基于轉錄組數(shù)據(jù)的α-法呢烯合成酶基因的篩選

本課題組先前完成了烏龍茶初制過程中關鍵節(jié)點(鮮葉、萎凋葉、做青葉、對照攤放葉)的轉錄組測序,通過本地Blast后,將1.2.3中檢索獲得的α-法呢烯合成基因得到逐一比對,結果如表2所示,基于Blast得分和E值,將CL11384.Contig7_All作為候選CsAFS基因。

將候選的CL11384.Contig7_All與1.2.3中的11條α-法呢烯合成相關基因比對后,發(fā)現(xiàn)TEA033306.1、TEA009170.1、TEA026271.1與CL11384.Contig7_All具有高度的同源性。通過TPIA網(wǎng)站查詢并對比的這三條α-法呢烯合成酶相關基因在不同山茶屬植物中的表達水平,結果如圖5所示,TEA026271.1基因僅在茶中表達水平較高(0.23),在列舉的其余同屬植物中普遍表達水平偏低,甚至不表達;TEA009170.1基因在茶(原變種)中表達水平最高(1.6),在龍井43中表達水平次之(1),在茶中則無明顯表達水平;TEA033306.1整體表達水平較其它兩個基因的表達水平高,在茶(原變種)中表達水平最高(2.75),在茶、龍井43中表達水平較高,分別為1、2。通過對比這三個基因在山茶屬植物中的基因表達水平,可以得出在進化和演變的過程中,具有較高相關基因表達水平的茶(原變種)、茶被篩選出來,通過加工帶來的外源脅迫促使葉片中相關基因表達,從而累積形成茶葉的賦香物質(zhì)。

通過Me_V軟件做圖后對比篩選出的5個轉錄本的FPKM值熱圖,結果如表3所示。僅考慮表達值(FPKM)大于10 的轉錄本[32],可知CL11384.Contig7_All表達值在搖青葉(T3)及其對照葉(CK3)分別為40.29和11.41,Unigene14516_All的表達值在T3中為12.74,而其余三個轉錄本(Unigene14691_All、Unigene32162_All、CL4238.Contig1_All)在各處理中FPKM均小于10,故舍棄。盡管差異性分析表明CL11384.Contig7_All和Unigene14516_All的T3和CK3的FPKM均存在極顯著差異(P<0.01),但通過對比二者T3和CK3的倍數(shù)差異(Fold_Change,FC)后發(fā)現(xiàn),CL11384.Contig7_All的FC(T3_vs_CK3)為3.53,而Unigene14516_All的FC(T3_vs_CK3)僅為1.40。因此將CL11384.Contig7_All作為候選基因進行后續(xù)研究。

表2 基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫的轉錄組中α-法呢烯合成酶基因的本地BlastTable 2 Local blast of CsAFS7 gene based on tea tree genemo database

表3 基于轉錄組數(shù)據(jù)的α-法呢烯合成酶基因在加工過程中的表達值(FPKM)Table 3 Expression value(FPKM)of CsAFS gene during manufacturing process of oolong tea based on transcriptome data

圖5 α-法呢烯合成酶基因的在不同山茶屬植物中的表達水平Fig.5 CsAFS gene expression levelin various Camellia species

利用MegaV_7.0結合在線工具iTOL(http://itol.embl.de/upload.cgi)構建轉錄組中篩選獲得的CL11384.Contig7_All核酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖6所示。結果表明,該基因的轉錄本與茶樹α-法呢烯合成酶基因(CsAFS)高度相似(Q_Cover=100%,E_value=0,Per. Ident=99.94%),與兩個茶樹萜烯類合成酶基因(CsTPS6、CsTPS9)存在較高的同源性。除茶樹中的法呢烯合成酶基因外,還對比獲得了一條歐洲栓皮櫟的(E,E)-AFS基因,但與轉錄本CL11384.Contig7_All的相似度較低。通過系統(tǒng)發(fā)育進化樹,進一步確定了轉錄組中篩選獲得的CL11384.Contig7_All來自于茶樹中的α-法呢烯合成酶基因的轉錄,因此將CL11384.Contig7_All命名為CsAFS7。

圖6 基于CL11384.Contig7_All核酸序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on nucleic sequences homology of CL11384.Contig7_All

2.3 烏龍茶加工過程中CsAFS基因的表達水平和驗證

AFS基因的表達對α-法呢烯合成與代謝有關鍵作用[33]。因此,結合轉錄組數(shù)據(jù),根據(jù)qRT-PCR結果中CsAFS7基因的表達量水平衡量茶葉在加工過程中的α-法呢烯含量水平,結果如圖7所示,隨著烏龍茶加工的進展,CsAFS7基因的表達水平呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,在鮮葉階段CsAFS7的表達水平最低,在第三次搖青葉處測得最高值(46.649)。

圖7 烏龍茶加工過程中相關CsAFS7基因的相對表達水平Fig.7 CsAFS7 gene relative expression levelduring oolong tea manufacturing process

實驗組中,T1處的CsAFS7表達水平約為T2處的26%,T2處的CsAFS7基因表達水平約為T3處的48%。對照組中,CsAFS7基因的表達水平呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在CK2處表達水平最高(14.003),在CK3時CsAFS7基因的表達水平明顯下降至最低值(0.766)。說明了茶葉在攤晾過程中受到的非生物脅迫對CsAFS7的表達水平有一定影響,但隨著自身水分的逸失,CsAFS7基因的表達水平逐漸降至最低。

實驗組與對照組的對比中,T3與CK3的組間基因表達水平存在極顯著差異(P<0.01)。說明了烏龍茶加工過程中,CsAFS7在外來機械力的作用下有較高的表達模式,且隨著機械脅迫作用的累加逐漸升高。

2.4 烏龍茶加工過程中α-法呢烯含量與CsAFS基因相對表達水平的相關性分析

利用皮爾遜(Pearson)相關系數(shù)評估茶樹CsAFS7基因的表達水平與α-法呢烯含量的相關性,結果如表4所示。實驗組中CsAFS7基因的表達水平與α-法呢烯含量存在極顯著正相關(r=0.951,P<0.01)。對照組中,CsAFS7基因的表達水平與α-法呢烯含量不存在顯著差異(r=-0.192)。由此推測,外源機械力的施加促使相關CsAFS基因的表達水平上調(diào),進而提高α-法呢烯的含量。

表4 烏龍茶加工過程中α-法呢烯豐度與CsAFS7基因相對表達水平的相關性分析Table 4 Correlation coefficient between α-farnesenecontent and relative expression level of CsAFS7 gene

3 討論與結論

3.1 茶樹AFS關鍵基因在茶組植物中的特異表達

通過與其他茶組植物比較,α-法呢烯合成酶關鍵基因的表達水平在茶(原變種)、龍井43中普遍高于其他茶組植物。盡管“茶”中α-法呢烯合成關鍵基因TEA026271.1、TEA009170.1的表達量高于其他茶組近源植物,但是卻均低于“茶(原變種)”和“龍井43”?！安?原變種)”的產(chǎn)生是人類將大葉茶向小葉茶、從喬木向灌木成功馴化的標志[34-36],而龍井43則是中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所在龍井群體種中選育出的國家優(yōu)良茶樹品種[37]。這或許可以解釋,帶有香氣的“茶”得到了人類的關注,在人類馴化和人工選育“茶”的過程中,香氣又是一個十分重要導向。同時,茶葉的采后處理促進了香氣的進一步釋放。Hu等[38]基于轉錄組測序和代謝組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)烏龍茶在做青過程中MEP和MVA途徑上結構基本呈現(xiàn)上調(diào)表達的模式,這為包括α-法呢烯在內(nèi)的VOCs的形成及釋放研究奠定了基礎。Jin等[39]基于轉錄組數(shù)據(jù)和代謝組測序數(shù)據(jù),建立起一個茶樹萜烯類代謝基因網(wǎng),發(fā)現(xiàn)一個與法呢烯形成有顯著正相關的萜烯類合成酶基因——TPS2,該基因與CsAFS基因具有較高的同源性,可以誘導α-法呢烯、β-法呢烯、β-羅勒烯的形成。本研究篩選獲得的CsAFS基因表達水平能促進搖青工藝的推進,該基因?qū)Ζ?法呢烯的誘導作用,有助于把握不同加工階段烏龍茶風味品質(zhì)的形成。

3.2 烏龍茶加工過程中α-法呢烯的形成和關鍵基因的表達

α-法呢烯是烏龍茶中關鍵的賦香物質(zhì)[40-41]?；诓煌募庸すに?茶葉被劃分為六大類,其中烏龍茶加工工藝最為繁雜[42],基于烏龍茶加工過程中關鍵節(jié)點樣品轉錄組測序,篩選獲得了轉錄本CL11384.Contig7_All,通過本地Blast后發(fā)現(xiàn)該轉錄組與TEA033306.1、TEA026271.1以及TEA009170.1具有較高的同源性,qRT-PCR的驗證后發(fā)現(xiàn)在做青葉中CL11384.Contig7_All的表達水平要明顯高于其他處理葉,并且與做青過程中α-法呢烯的累積存在極顯著的正相關,相關系數(shù)為0.951(P<0.01),該結果進一步說明了做青是烏龍茶天然馥郁花果香品質(zhì)形成的核心工藝。烏龍茶做青過程中,萎凋適度的鮮葉在反復的搖青和攤放過程中,葉片加速失水并產(chǎn)生局部損傷,包括α-法呢烯在內(nèi)的萜類[43]、脂肪族類[44-45]、苯丙烷及苯環(huán)類等[46]帶有芳香氣味的物質(zhì)逐步形成并釋放。與等時間未搖青的對照組(CK)相比,第三次搖青葉(T3)的α-法呢烯含量極顯著高于對照組(P<0.01),這說明搖青機械力在做青中后期的介入,CL11384.Contig7_All表達水平開始顯著上調(diào),α-法呢烯開始大量累積并釋放,因此這個階段可能是烏龍茶天然花果香品質(zhì)形成的關鍵時期。而有趣的是,T1中的α-法呢烯含量顯著低于CK1中的α-法呢烯含量(P<0.05)。這可能是在做青伊始階段,搖青機械力初次介入,與失水共同形成做青過程中的雙重脅迫效益[47],盡管關鍵基因CL11384.Contig7_All的轉錄已經(jīng)完成,但生理層次上,相關酶力及α-法呢烯的含量尚未同步,這與Zhou等[48]研究中同樣指出了外源機械力的介入,初始LOX-HPL途徑上ADH酶活力及基因表達水平均呈現(xiàn)先下降而后升高的趨勢。Qian等[49]則闡釋了葡萄采后的過程中分子層次和生理層次的反應差異,認為生理層次的反應要普遍滯后于分子層次。與本研究不同,佛手品種在付制烏龍茶過程中,α-法呢烯不論是釋放量還是葉片中的殘余量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,而綠茶品種“浙農(nóng)319”則呈現(xiàn)不斷上升積累的趨勢[50],這種差異可能是烏龍茶品種和采后處理的差異導致。