遞推式ARTPUV復(fù)合誘變篩選高產(chǎn)β葡萄糖苷酶菌株

夏俊芳,王小靈,古麗娜孜,韓貴林,武 運(yùn)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是從糖苷前體釋放單萜物質(zhì)的關(guān)鍵酶[1]，能夠水解葡萄汁糖苷結(jié)合態(tài)香氣前體,釋放揮發(fā)性糖苷配基,形成濃郁豐富的葡萄酒風(fēng)味。葡萄酒中的糖苷酶可來源于葡萄果實(shí)、酵母菌(釀酒酵母和非釀酒酵母)、乳酸菌及商品化外源性酶制劑[2],早在1989年Laffort等[3]研究發(fā)現(xiàn)酵母菌株可以通過水解共軛芳香前體來改善和增強(qiáng)葡萄酒的香氣,但從自然環(huán)境分離得到的野生型菌株的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力有限,已有學(xué)者利用紫外誘變、硫酸二乙基酯、亞硝基胍、紫外-亞硝基胍-Co60復(fù)合誘變、紫外-甲基磺酸乙酯復(fù)合誘變等物理、化學(xué)方法篩選得到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。張莉等[4]通過紫外誘變得到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定的突變菌株UV-45,酶活達(dá)到75.34 U/mL,較出發(fā)菌株提高41.64%;王婧等[5]通過硫酸二乙酯(DES)誘變得到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定的突變菌株UV-E-16,酶活達(dá)到74.26 U/mL;劉文龍等[6]通過亞硝基胍誘變獲得產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的突變株AN-17,酶活達(dá)到291 U/mL;陳軍杰等[7]通過紫外-亞硝基胍-Co60復(fù)合誘變獲得產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的突變菌株N-9,酶活力穩(wěn)定在8.5 U/mL左右,是原出發(fā)菌株的2.1倍;鄭賢金等[8]通過紫外—甲基磺酸乙酯復(fù)合誘變獲得產(chǎn)β-葡萄糖苷酶突變菌株TZ-03,酶活達(dá)到10.53 IU/mL,是原出發(fā)菌株的 1.52倍。但這些常規(guī)物理、化學(xué)誘變法對(duì)操作員的健康和突變效率都存在一定程度上的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

近年來,一種新型誘變育種方法——常壓室溫等離子體誘變(ARTP)因其突變速度快、突變體多樣性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單安全等特點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注[10],與其它誘變方法相比,ARTP處理對(duì)活細(xì)胞的DNA損傷更明顯,突變率更高[11]。ARTP采用99.999%的高純氦氣(He)為出發(fā)氣體在高頻電場(chǎng)中產(chǎn)生富含活性的高能粒子,高能粒子作用于整個(gè)微生物細(xì)胞改變了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性并造成細(xì)胞損傷,生物細(xì)胞被迫開啟SOS修復(fù)機(jī)制,引起基因突變使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化,最終獲得大量穩(wěn)定的突變菌株,ARTP能有效地引起DNA的多樣性損傷,增加誘變突變率且不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)[12],它已成功地用于細(xì)菌[13-14]、酵母菌[5,15]、霉菌[16-17]、食用菌[18-19]等生物育種以提高生物量和代謝產(chǎn)物。僅進(jìn)行一輪ARTP誘變,不可能獲得理想的突變體,為了獲得預(yù)期的目標(biāo),可采用遞推式ARTP方法以獲得更多的突變體,Jiang等[20]采用8輪遞推式ARTP誘變提高茂原鏈霉菌產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能力;也可采用ARTP與其它誘變方法聯(lián)合來提高整體誘變效率,如聯(lián)合采用硫酸二乙酯[21]、亞硝基胍[22]、紫外輻射[23]來提高誘變效率。

本研究對(duì)前期赤霞珠(Cabernetsauvignon)自然發(fā)酵過程中的兩株野生釀酒酵母G13、G21菌株采用遞推式ARTP-UV復(fù)合誘變,以β-葡萄糖苷酶活力為主要篩選指標(biāo),旨在獲得高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株并為其后續(xù)在葡萄酒釀造及提升葡萄酒香氣中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出發(fā)菌株:產(chǎn)β-葡萄糖苷酶優(yōu)良酵母G13釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、G21釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室;商業(yè)酵母D254 煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司;YPD固體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、2%瓊脂;YPD液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L 均為北京奧博星責(zé)任有限公司;以上培養(yǎng)基均以121 ℃滅菌15 min后備用;初篩培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、2%瓊脂,滅菌后溫度降至60 ℃加入1 g/L p-NPG;p-NPG(pH5.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制) 美國(guó)Sigma 公司;對(duì)硝基苯酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

FE20 PLUS pH計(jì) 上海梅特勒托利多儀器有限公司;DJ100-3型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;DY04-13-44-00壓力蒸汽滅菌器 上海東亞壓力容器制造有限公司;722可見分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司;THZ-98AB恒溫培養(yǎng)振蕩箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HSY2-SP電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;HR40-IIAI生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司;ARTP誘變育種儀 無錫源清天木生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將保藏的G13、G21菌株接種到斜面中,28 ℃培養(yǎng)48 h,然后將斜面上的菌種接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中,在28 ℃,200 r/min恒溫振蕩箱中培養(yǎng)18 h,經(jīng)稀釋倒平板計(jì)數(shù),G13菌懸液濃度為3.5×108CFU/mL,G21菌懸液濃度為1.08×108CFU/mL。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線繪制 將108CFU/mL的G13、G21菌株以5%接種量分別接種到滅菌的含100 mL YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中,于28 ℃,200 r/min搖瓶培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h后分別在OD600下測(cè)吸光值(未接菌的發(fā)酵液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照),以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制菌株生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.3 ARTP誘變 按照ARTP生物誘變儀的操作流程,以高純氦氣為工作氣體,無菌條件吸取10 μL 1.2.1制備的孢子懸液均勻涂布于載片表面,功率為120 W,等離子體的溫度為30 ℃,氣流量為10 SLM,工作距離為2 mm。處理時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180 s,涂布于YPD平板,28 ℃避光培養(yǎng)48 h,計(jì)算不同處理時(shí)間的致死率,公式如下:

其中:菌液處理時(shí)間0為對(duì)照組,稀釋涂布菌落計(jì)數(shù)為A,菌液處理一定時(shí)間為實(shí)驗(yàn)組,稀釋涂布菌落計(jì)數(shù)為B。

測(cè)定突變株酶活,以相對(duì)于出發(fā)菌株酶活增長(zhǎng)20%為正突變,每個(gè)處理挑取200株以上突變株測(cè)定酶活,以減少酶活測(cè)定誤差帶來的正突變率計(jì)算誤差,計(jì)算誘變正突變率,公式如下:

其中:實(shí)驗(yàn)組菌株產(chǎn)酶活高于出發(fā)菌株20%的突變株計(jì)數(shù)為C。

通過致死率和正突變率來確定G13、G21菌株ARTP誘變最佳處理時(shí)間。

1.2.4 紫外誘變(UV) 取1.2.1制備的孢子懸液5 mL于無菌平皿中,紫外(功率15 W,燈距30 cm),照射30、60、90、120、150、180 s。將誘變處理后的孢子懸液適當(dāng)稀釋涂布于YPD平板,28 ℃避光培養(yǎng)48 h,根據(jù)1.2.3計(jì)算致死率和正突變率,通過致死率和正突變率來確定G13、G21菌株UV誘變最佳處理時(shí)間。

1.2.5 ARTP誘變菌株的篩選 G13菌株經(jīng)ARTP120 s誘變后,G21菌株經(jīng)ARTP 90 s誘變后,在平皿上各挑取15個(gè)菌落直徑比較大的單菌落,依次編號(hào)(如GD13-13表示ARTP誘變120 s的第13號(hào)菌株),進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,測(cè)β-葡萄糖苷酶酶活。

1.2.6 遞推式連續(xù)ARTP誘變 選育連續(xù)3輪ARTP誘變,選擇β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量最高的突變菌株,作為下一輪ARTP誘變的起始菌株。

1.2.7 遞推式ARTP-UV復(fù)合誘變 以1.2.6每輪ARTP誘變的最高酶活的突變菌株,作為下一輪UV誘變的起始菌株,進(jìn)行2輪UV誘變。

1.2.8 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株篩選 將誘變后長(zhǎng)出的菌落,選擇較大、圓滿、香味濃郁的菌落劃線接種在初篩平板上,28 ℃培養(yǎng)48 h,根據(jù)黃色光圈選取單個(gè)菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,發(fā)酵條件為28 ℃、200 r/min,培養(yǎng)48 h后測(cè)定酶活,選出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活菌株。

1.2.9β-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定 參照侯曉瑞等[24]的方法,對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=20.607X+0.0119,決定系數(shù)R2=0.9996,吸光度與對(duì)硝基苯酚含量成線性關(guān)系。吸取0.1 mL粗酶液與0.2 mL 35 mmol/L p-NPG(即以pH=5.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制而成)混勻,50 ℃保溫10 min,加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)并顯色,于400 nm下測(cè)定吸光值。以加熱滅活的酶液同樣處理做空白對(duì)照并測(cè)定吸光值。

酶活力計(jì)算公式如下:

式中:U為酶活力單位,U/mL;C為對(duì)硝基苯酚(p-NPG)的濃度,μmol/L;V為反應(yīng)體系的體積,mL;N為原酶液稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時(shí)間,min;0.1為所取上清液或細(xì)胞液的體積。

酶活力定義:酶活力單位(U)定義為在pH5.0,50 ℃反應(yīng)條件下,1 min水解1 nmol p-NPG所需要的酶量。

1.2.10 傳代穩(wěn)定性試驗(yàn) 將酶活力高的突變菌株在YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)5代培養(yǎng),培養(yǎng)條件為28 ℃,200 r/min恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h,按照1.2.9對(duì)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定,檢測(cè)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序,差異顯著性(P<0.05)分析使用 Tukey HSD程序,采用Excel 2016整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 G13、G21生長(zhǎng)曲線繪制

菌株G13、G21生長(zhǎng)曲線如圖1所示,接種4 h內(nèi)菌體濃度沒有變化,是菌株延滯期;4 h 后G13、G21進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,當(dāng)適應(yīng)環(huán)境后4～24 h菌株進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期;28 h后,菌體分解代謝與合成代謝的速度基本一致,菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞為生理活性旺盛,突變率高,重現(xiàn)性好,菌體活力旺盛,故后續(xù)試驗(yàn)選擇培養(yǎng)18 h的菌體進(jìn)行誘變處理。

圖1 菌株G13、G21的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of G13 and G21

2.2 ARTP誘變時(shí)間優(yōu)化

如圖2所示,隨著處理時(shí)間的增加,菌體的致死率逐漸增大,菌株G13處理120 s時(shí),G13致死率為92.70%,正突變率達(dá)到最大為19%;菌株G21處理90 s時(shí),G21致死率為92.29%,正突變率達(dá)到最大為20%;處理150 s時(shí),G13、G21致死率分別達(dá)到97.65%、97.20%;處理180 s時(shí),ARTP的致死率分別為98.50%、99.00%,表明ARTP的誘變作用非常劇烈。李小坤等[25]利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)選育高核酸釀酒酵母及其特性時(shí),分析致死率90%～95%時(shí)突變效應(yīng)最強(qiáng),本試驗(yàn)結(jié)合正突變率,G13菌株ARTP誘變最佳處理為120 s,G21菌株ARTP誘變最佳處理為90 s。

圖2 ARTP誘變時(shí)間對(duì)G13、G21菌株致死率、正突變率的影響Fig.2 Influence of ARTP radiation timeon mortality and mutation rate on G13 and G21

2.3 UV誘變時(shí)間優(yōu)化

由圖3可知,隨著紫外處理時(shí)間的增加,菌體的致死率逐漸升高,紫外誘變照射時(shí)間不短于10～20 s,不長(zhǎng)于10～20 min,菌株G13、G21處理時(shí)間90 s時(shí),G13致死率約為91.5%,正突變率達(dá)到最大為17%,G21致死率約為90.2%,正突變率達(dá)到最大為19%。致死率90%～95%時(shí)突變效應(yīng)最強(qiáng),結(jié)合正突變率,G13、G21菌株UV誘變最佳處理時(shí)間均為90 s。

圖3 紫外誘變時(shí)間對(duì)G13、G21菌株致死率、正突變率的影響Fig.3 Influence of UV radiation timeon mortality and mutation rate on G13 and G21

2.4 ARTP誘變菌株的確定

表1列舉了β-葡萄糖苷酶活性較高的部分代表菌株,經(jīng)過ARTP誘變所得菌株最高酶活為GD13-09和GD21-12,酶活分別達(dá)到156.95、132.72 U/mL是出發(fā)菌株G13、G21菌株酶活的3.0和2.7倍,表明通過ARTP誘變獲得的菌株酶活能力明顯高于出發(fā)菌株G13、G21。

表1 ARTP誘變菌株的初篩結(jié)果(部分代表菌株)Table 1 Preliminary screening results ofARTP mutant strains(Partial representative strains)

2.5 ARTP傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

GD13-09和GD21-12兩菌株在ARTP傳代中酶活的穩(wěn)定性結(jié)果見表2,同菌株不同傳代次數(shù)產(chǎn)酶活力比較,GD13-09和GD21-12菌株前兩代菌株產(chǎn)酶活力穩(wěn)定性差異不顯著(P>0.05),傳至第三代菌株產(chǎn)酶能力降低,酶活穩(wěn)定性差異顯著(P<0.05),表明ARTP傳代穩(wěn)定性不穩(wěn)定,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展遞推式復(fù)合誘變。

表2 ARTP傳代穩(wěn)定性(酶活，U/mL)Table 2 Stability test of ARTP consecutive generation of two mutant strains(enzyme activity,U/mL)

2.6 遞推式連續(xù)ARTP誘變

每輪進(jìn)入搖瓶復(fù)篩的突變株發(fā)酵的酶活統(tǒng)計(jì)分別如圖4～圖6所示。圖中,最左側(cè)的菌株為該輪篩選的出發(fā)菌株,即上一輪篩選得到的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活最高的菌株。

圖4,第一輪ARTP誘變,G13D1-Dea組的酶活最高,達(dá)到了156.95 U/mL;G21D1-Dba組的酶活最高,達(dá)到了132.72 U/mL,故選擇G13D1-Dea和G21D1-Dba這兩組菌中的高產(chǎn)菌株作為第二輪ARTP誘變的出發(fā)菌株。

圖4 第一輪ARTP誘變篩選菌株發(fā)酵酶活統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistic results of screeningin ARTP fermentation for the first round

圖5,第二輪ARTP誘變,G13D2-Dka組的酶活最高,達(dá)到了187.86 U/mL;G21D2-Dma組的酶活最高,達(dá)到了175.24 U/mL,故選擇G13D2-Dka和G21D2-Dma這兩組菌的高產(chǎn)菌株作為第三輪ARTP誘變的出發(fā)菌株。

圖5 第二輪ARTP誘變篩選菌株發(fā)酵酶活統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistic results of screening inARTP fermentation for the second round

圖6,第三輪ARTP誘變,第二輪的起始酶活組G13D3-Dva、G21D3-Dva酶活最高,排除出發(fā)菌株酶活,第三輪誘變的最高酶活組是G13D3-Dbb酶活為178.32 U/mL,G21D3-Dwa組酶活為160.62 U/mL。相比前兩輪誘變,第三輪菌株酶活降低,表明連續(xù)三輪ARTP誘變突變庫(kù)菌株生長(zhǎng)變慢,不利于進(jìn)一步誘變篩選進(jìn)行,因此結(jié)合傳統(tǒng)的紫外誘變方法進(jìn)行復(fù)合處理。

圖6 第三輪ARTP誘變篩選菌株發(fā)酵酶活統(tǒng)計(jì)Fig.6 Statistic results of screening inARTP fermentation for the third round

2.7 遞推式ARTP-UV復(fù)合誘變

第一輪G13菌株ARTP-UV復(fù)合誘變的結(jié)果如圖7、圖8所示,分別選擇ARTP三輪的高產(chǎn)酶活菌株進(jìn)行UV誘變90 s,圖7表明,G13復(fù)合誘變的高酶活組是Dbb,平均酶活達(dá)到了191.52 U/mL;圖8表明,G21復(fù)合誘變的高酶活組是Dma,平均酶活達(dá)到了176.15 U/mL。

圖7 第一輪G13-ARTP-UV誘變篩選菌株發(fā)酵酶活統(tǒng)計(jì)Fig.7 Statistic results of G13 screening inARTP-UV fermentation for the first round注:Dea組:G13第一輪ARTP最高酶活菌株組,Dka組:G13第二輪ARTP最高酶活菌株組,Dbb組:G13第三輪ARTP最高酶活菌株組,每組選取4株產(chǎn)酶菌株,圖中不同底紋代表不同菌株;圖9同。

圖8 第一輪G21-ARTP-UV誘變篩選菌株發(fā)酵酶活統(tǒng)計(jì)Fig.8 Statistic results of G21screening inARTP-UV fermentation for the second round注:Dba組:G21第一輪ARTP最高酶活菌株組,Dma組:G21第二輪ARTP最高酶活菌株組；Dwa組:G21第三輪ARTP最高酶活菌株組,每組選取4株產(chǎn)酶菌株,圖中不同底紋代表不同菌株;圖10同。

第二輪ARTP-UV復(fù)合誘變的結(jié)果如圖9、圖10所示,第一輪ARTP-UV復(fù)合誘變的三組高產(chǎn)酶活組菌株再進(jìn)行UV誘變90 s,由圖9可知,G13復(fù)合誘變的高酶活組是Dea組,平均酶活達(dá)到了231.53 U/mL;由圖10可知,G21復(fù)合誘變的高酶活組是Dma組,平均酶活達(dá)到了177.81 U/mL。對(duì)誘變酶活統(tǒng)計(jì),G13、G21最高酶活誘變方式是一輪ARTP誘變兩輪UV誘變,經(jīng)過遞推式復(fù)合誘變,極大地提高了菌株的產(chǎn)酶能力。

表3 ARTP-UV傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)(酶活，U/mL)Table 3 Stability test of ARTP-UV consecutive generation of two mutant strains(cnzyme activity,U/mL)

圖9 第二輪G13-ARTP-UV誘變篩選菌株發(fā)酵酶活統(tǒng)計(jì)Fig.9 Statistic results of G13 screening inARTP-UV fermentation for the first round

圖10 第二輪G21-ARTP-UV誘變篩選菌株發(fā)酵酶活統(tǒng)計(jì)Fig.10 Statistic results of G21 screening inARTP-UV fermentation for the second round

2.8 遞推式復(fù)合(ARTP-UV)傳代穩(wěn)定性分析

由表3,經(jīng)過5輪傳代ARTP-UV復(fù)合誘變篩選的菌株酶活遺傳穩(wěn)定性差異不顯著(P>0.05),平均酶活分別是出發(fā)菌株G13(52.22 U/mL)、G21(48.33 U/mL)的4.61倍和3.59倍。采用遞推式ARTP-UV復(fù)合誘變技術(shù)作為新型的誘變方法,對(duì)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的誘變選育而言,具有良好的突變效果。

3 結(jié)論與討論

ARTP誘變技術(shù)是一種新型誘變育種技術(shù),具有快速、有效、安全、操作簡(jiǎn)便、環(huán)境友好、對(duì)操作者安全無輻射、正突變率高等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于微生物育種。ARTP可在常壓室溫下均勻產(chǎn)生各種活性粒子,這些活性粒子可以穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,破壞DNA分子,引起突變,從而改變目標(biāo)微生物的代謝網(wǎng)絡(luò),獲得大容量突變庫(kù)[18]。與常規(guī)化學(xué)誘變相比,ARTP有很強(qiáng)的基因損傷能力,Zhang等[26]以沙門氏菌NM2009為模型菌株,通過ARTP、UV、和化學(xué)誘變處理對(duì)DNA損傷進(jìn)行定量評(píng)價(jià)和比較,發(fā)現(xiàn)ARTP對(duì)單個(gè)活細(xì)胞的DNA損傷更大,由于DNA損傷是生物突變的根源[27],因此,ARTP確實(shí)能夠作為微生物誘變的有效手段,并在生物誘變育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

誘變的方式包括單一誘變劑連續(xù)誘變或多種誘變劑交替以及連續(xù)誘變,Zou等[11]采用兩輪ARTP誘變紫色白僵菌得到AR01菌株產(chǎn)CoQ10產(chǎn)量比原菌株高25.5%,Luo等[28]采用30輪ARTP誘變得到30000突變體,在500 mL搖瓶和3 L發(fā)酵罐中,篩選出H6突變體產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量較原始菌株分別高出32.2%和35.4%。也有很多研究采用多種復(fù)合誘變的方法以提高菌株產(chǎn)相應(yīng)代謝產(chǎn)物含量能力,Li等[21]采用ARTP結(jié)合硫酸二乙酯選育出高產(chǎn)花生四烯酸的突變菌株D20,其活力較原始菌株提高了40.61%;Feng等[17]聯(lián)合采用微波誘變、紫外線誘變、熱氯化鋰、ARTP 聯(lián)合誘變米曲霉KA-11得到高產(chǎn)曲酸的AR-47突變菌株,曲酸含量為96.5 g/L。劉文龍等[29]將ARTP與紫外線復(fù)合誘變選育高產(chǎn)酸性蛋白酶黑霉菌株SA-08,其活力較出發(fā)菌株提高83.71%;任林英等[30]采用紫外與ARTP復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)子囊霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌進(jìn)行誘變處理,其產(chǎn)子囊霉素能力較出發(fā)菌株提高4倍以上,發(fā)酵單位達(dá)568.0 μg/mL;高芳霞等[31]采用ARTP與紫外誘變技術(shù)對(duì)達(dá)托霉素產(chǎn)生菌玫瑰孢鏈霉菌進(jìn)行復(fù)合誘變獲得一株達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到3.9 g/L的突變株Q12-63#,發(fā)酵單位較出發(fā)菌株提高了37%。Ottenheim C 等[32]也提出由于缺乏比較研究,不能簡(jiǎn)單得出結(jié)論:遞推式ARTP誘變或者ARTP與傳統(tǒng)誘變方法組合優(yōu)于單一的ARTP誘變。

本研究將ARTP與UV結(jié)合,采用遞推式連續(xù)誘變篩選出具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的突變株Dea-G13D1Z2和Dma-G21D1Z2,突變菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中于28 ℃,200 r/min搖床發(fā)酵48 h,經(jīng)過5輪傳代,遺傳穩(wěn)定性能良好,產(chǎn)β-葡萄糖苷酶平均活性分別為240.93和173.38 U/mL，為出發(fā)菌株G13、G21的4.61倍和3.59倍,此酶活力也普遍高于已經(jīng)報(bào)道的釀酒酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的酶活[4-5],后續(xù)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件,以最大限度地發(fā)揮菌株的優(yōu)良性能,提高產(chǎn)量。