紫草素衍生物誘導(dǎo)肺癌細胞A549細胞周期阻滯及細胞凋亡

郝瑩瑩，于佳斌，練旭冬，謝丹萍，毛瑩瑩，劉曉冬，賀鑫梅，金成浩，申貴男*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

紫草為多年生傳統(tǒng)中藥材，可治療丹毒、燒傷等疾病[1]，其中以紫草素(Shikonin)為主要代表的萘醌類化合物是紫草中含量較多的化學(xué)活性成分[2]。萘醌類化合物具有包括抗癌、抗氧化在內(nèi)的多種生理藥理功能，但除了外用的燒燙傷治療劑外，尚未得到廣泛的臨床應(yīng)用[3-5]。

多項研究表明，萘醌類衍生物在生物體內(nèi)可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡以及導(dǎo)致細胞周期阻滯的方式抑制體內(nèi)腫瘤和癌癥細胞的生長[6-7]。其誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯可以通過多種關(guān)鍵信號蛋白介導(dǎo)，例如P53與MAPKs(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)家族蛋白[8-9]。紫草素可以使黑色素瘤細胞A375-S2的P53蛋白表達量增加，增高的P53蛋白激活促凋亡蛋白質(zhì)Bax，進一步導(dǎo)致細胞線粒體大量釋放細胞色素c激活caspase家族蛋白，誘導(dǎo)細胞發(fā)生線粒體依賴的細胞凋亡[10-11]。多項研究還表明MAPKs信號通路在細胞增殖、分化以及凋亡的過程中均起到重要調(diào)節(jié)作用[12]。前期研究表明，紫草素及其衍生物的生物活性主要來自于萘環(huán)羰基的親電作用，通過結(jié)構(gòu)修飾提高萘醌類衍生物的選擇性并降低細胞毒性是化學(xué)合成的主要研究方向[13-15]，羥基的甲基化正可大大降低萘醌母核5,8位羥基的較強細胞毒性[3]。

本實驗設(shè)計合成了兩種不同長度的2-取代萘醌類衍生物，對肺癌細胞A549的抗癌活性進行評價后探究了活性較強的2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮 (a) 抑制A549細胞周期阻滯和細胞凋亡的分子機制，以及不同長度，不同取代基基團對萘醌類衍生物構(gòu)效關(guān)系有何影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞系 A549 使用黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細胞庫的凍存細胞。

1.2 試劑及儀器

1,4-二甲氧基苯、馬來酸酐、無水三氯化鋁、對甲苯磺酸甲酯、氯化鈉、濃鹽酸、石油醚60-90、無水碳酸鈉、鄰二氯苯、正辛硫醇、正辛胺、濃硫酸、重鉻酸鈉、間氯過氧苯甲酸、碳酸氫鈉、二甲基亞砜、無水硫酸鈉均購自阿拉丁公司。DMEM/高糖(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；抗p-JNK、p-ERK、p-P38、JNK、ERK、P38、P53、P21(Sigma-Aldrich)；Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E、α-tubulin抗體(Santa Cruz公司)；硝酸纖維素膜(Millipore公司)；細胞凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒(Sigma-Aldrich)；MTT(Amresco公司)；NC膜(PALL公司)；ECL(Thermo公司)；培養(yǎng)皿(NEST公司)；蛋白免疫印跡系統(tǒng)(Amersham Bioscience公司)；PE SCIX API2000 MS/MS質(zhì)譜分析儀(SCIEX公司)；AVANCE DPX-400 超導(dǎo)核磁共振譜儀(布魯克公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO)；多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司)。

1.3 化合物合成

化合物的中間體5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮以1,4-二甲氧基苯和馬來酸酐為原料同三氯化鋁、氯化鈉155 ℃熔融反應(yīng)獲得5,8-二羥基萘-1,4-二酮，利用甲基化試劑對甲苯磺酸甲酯、碳酸鈉進行甲基化獲得[17]。

1.3.1 2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(a)的合成

將5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(266.2 mg,1.22 mmol)溶于30 mL甲醇、加正辛硫醇(212.1 mg,1.45 mmol)，室溫攪拌6 h，加入濃硫酸(5 mL)和重鉻酸鈉(223.5 mg,0.75 mmol)的混合水溶液25 mL，繼續(xù)攪拌2 min，氯仿萃取，脫水濃縮干燥后，乙醇重結(jié)晶得2-辛巰基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮。

將2-辛巰基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(442.2 mg,0.35 mmol)溶于30 mL氯仿。分4次加入間氯過氧苯甲酸(65.6 mg,0.38 mmol)，0 ℃反應(yīng)，薄層層析法觀察反應(yīng)進程，至2-辛巰基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮反應(yīng)完畢，立即加入10 %碳酸氫鈉水溶液(5 mL)終止反應(yīng)。加入飽和氯化鈉水溶液(30 mL)利用氯仿提取兩次，脫水濃縮干燥后，硅膠柱層析得2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘1,4-二酮(a)。

1.3.2 2-辛胺基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(b)

將5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(266.2 mg,1.22 mmol)溶于30 mL甲醇、加正辛胺(187.4 mg,1.45 mmol)，室溫攪拌6 h，加入濃硫酸(5 mL)和重鉻酸鈉(223.5 mg,0.75 mmol)的混合水溶液25 mL，繼續(xù)攪拌2 min，氯仿萃取，脫水濃縮干燥后，硅膠柱層析得2-辛胺基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(b)。

1.4 細胞培養(yǎng)

將從液氮取出的肺癌細胞(A549)復(fù)蘇后培養(yǎng)于CCM高糖培養(yǎng)基內(nèi)(CCM高糖培養(yǎng)基含10 %滅活的胎牛血清和1 %青霉素/鏈霉素)，將細胞放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h，24 h后可進行細胞換液，48h后可進行細胞傳代(環(huán)境保持37 ℃、5% 的CO2及飽和濕度)。

1.5 MTT檢測細胞增殖抑制

將第3代對數(shù)生長期狀態(tài)良好，形態(tài)飽滿的A549細胞接種于96孔的細胞培養(yǎng)板中(5×104個mL-1)，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的化合物a和b繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后每孔加入10 μL的MTT試劑(5 mg/mL)輕柔混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后棄去除上層培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，37℃孵育15 min，15 min后輕柔吹打混勻，酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處溶液吸光值。

1.6 增殖曲線繪制

將第3代對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好，形態(tài)飽滿的A549細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(5×104個mL-1)，培養(yǎng)24 h，分別于第1、3、5和7天每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h。4h后棄除上層培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，37℃孵育15 min，15 min后輕柔吹打混勻，酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處溶液吸光值后將吸光值匯總分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法分析

將藥物處理后的細胞離心回收，加入提前配制好的蛋白質(zhì)裂解液將細胞混勻使其裂解，離心20 min (12000 r/min、4 ℃)，回收蛋白質(zhì)上清。將15 μg的總蛋白在12 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行凝膠電泳，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉后用抗p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-P38、P38、P53、P21、Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B1和α-tubulin一抗(1:2000)在4 ℃下孵育過夜。棄去一抗后用TBST緩沖液(含0.2 % Tween-20、15 mmol/L 氯化鈉和10 mmol/L Tris-Hcl)洗滌5次，每次5 min，與HRP標(biāo)記二抗(鼠或兔、1∶5000)孵育2 h，洗膜、ECL顯色、成像并分析結(jié)果。

1.8 細胞周期及細胞凋亡檢測實驗均參照試劑盒說明進行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用繪圖軟件SigmaPlot繪圖，多組均數(shù)采用t檢驗進行比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01為有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.001為有極其顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 萘醌類衍生物的合成與鑒定

2-Octylsulfinyl-5,8-dimethoxy-naphthalene-1,4-dione (a):1H NMR (CDCl3,400 MHz) δ 7.41 (d,J = 9.2 Hz,1H),7.36 (d,J = 9.6 Hz,1H),7.30 (s,1H),3.99 (s,6H),3.23 (m,1H),2.90 (m,1H),1.90 (m,1H),1.64 (m,1H),1.45 (m,2H),1.25 (m,8H),0.87 (t,J = 7.2 Hz,3H); ESI-MS: m/z 400.8 (M+Na)+。

2-Octylamino-5,8-dimethoxy-naphthalene-1,4-dione (b):1H-NMR (CDCl3,400 MHz) δ 7.34 (d,J = 9.6 Hz,1H),7.18 (d,J = 9.6 Hz,1H),5.69 (br,1H),5.61 (s,1H),3.96 (s,3H),3.94 (s,3H),3.11 (q,J=6.8 Hz,2H),1.68～1.61 (m,2H),1.41-1.20 (m,10H),0.88 (t,J=6.4 Hz,3H); m/z 346 (M+H)+。

根據(jù)波譜學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2種產(chǎn)物為目標(biāo)化合物。化合物的合成路線如下(Fig.1)。

圖1 萘醌類衍生物a、b的合成路線

2.2 化合物a對A549細胞具有明顯的增殖抑制作用

為檢測含有不同取代基的萘醌類衍生物對A549細胞的增殖抑制效果，以1、3、5、7、9、11、13、15μmol/L濃度的2種萘醌類化合物處理A549細胞24 h，通過MTT assay的方法對A549細胞活力進行檢測(圖2)。結(jié)果顯示，化合物a濃度依賴性的抑制A549細胞；而化合物b在各濃度梯度均未顯示出抑制活性。說明不同取代基(辛亞砜與辛胺基)對萘醌類衍生物的抗癌活性影響較大，巰基取代顯示較好的抑制A549細胞增殖活性，而氨基取代導(dǎo)致化合物不能抑制A549細胞的增殖能力。

圖2 萘醌類衍生物對A549細胞活力影響 MTT法檢測A549細胞活力.***P<0.001,compared with control (0 μmol/L) group

2.3 化合物a抑制A549細胞增殖并導(dǎo)致G0/G1期阻滯

上述結(jié)果證明化合物a對A549細胞具有明顯的生長抑制作用，隨后通過3 μmol/L 化合物a處理A549細胞繪制出的生長曲線(圖3A)，以及0、3、8、12 μmol/L 濃度處理A549細胞6 h的細胞周期變化情況(圖3B)可知，化合物a在3 μmol/L濃度下對A549細胞增殖具有顯著地抑制作用。細胞周期的數(shù)據(jù)顯示，化合物a可導(dǎo)致A549細胞發(fā)生顯著的G0/G1期阻滯，且阻滯百分比呈藥物濃度依賴性。

圖3 化合物a抑制A549增殖和G0/G1細胞周

期阻滯 (A)3 μmol/L化合物a處理A549細胞繪制生長曲線；***P<0.001,與空白對照組(0 μmol/L) 比較 (B) 檢測0、3、8、12 μmol/L 化合物a處理A549細胞6 h的細胞周期變化情況。

2.4 化合物a對A549細胞P53、MAPKs和細胞周期蛋白的影響

P53作為體內(nèi)的抑癌基因，在正常細胞中表達較少，但是其在防止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著非常重要的角色，P53蛋白可與P21基因調(diào)節(jié)區(qū)相互結(jié)合，激活P21基因轉(zhuǎn)錄，抑制Cyclin D，CDK4/6復(fù)合體和CyclinE導(dǎo)致細胞停滯在細胞周期的G1期[18]。MAPKs信號通路也可以介導(dǎo)細胞凋亡，細胞周期阻滯以及細胞因子的分泌等過程。因此對P53及MAPKs的檢測有助于深入探討2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮的結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系。經(jīng)過檢測0、3、8、12 μmol/L 化合物a處理6 h后A549細胞的P53/P21信號關(guān)鍵蛋白，MAPKs信號通路關(guān)鍵蛋白以及細胞周期相關(guān)蛋白(圖4)。結(jié)果顯示，P53，P21的表達水平和P38，ERK的磷酸化水平以及多種細胞周期蛋白的表達水平都隨化合物濃度的增加而顯著增加，但是JNK的磷酸化水平無明顯變化。以上結(jié)果顯示，化合物a可激活A(yù)549細胞中P53、P38和ERK信號通路。

圖4 化合物a對A549細胞P53、MAPKs和細胞周期蛋白的影響

2.5 化合物a可導(dǎo)致A549細胞凋亡

萘醌類化合物可誘導(dǎo)多種細胞發(fā)生凋亡，通過檢測化合物a對A549細胞凋亡的影響(圖5)。顯示，在6 h處理時，化合物a并不會引起細胞凋亡(圖5A)，這與之前細胞周期Sub/G0期的變化相一致(圖3)，但是結(jié)果顯示相應(yīng)的信號通路已經(jīng)被激活(圖5B)。因此延長處理時間來檢測A549細胞凋亡和細胞周期的情況，結(jié)果顯示，在較長時間處理(12 h、24 h、48 h)處理時，部分A549細胞發(fā)生細胞凋亡，并且隨處理時間的延長凋亡的細胞逐漸增多(圖5C、D)。以上結(jié)果證明，化合物a可顯著誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生細胞凋亡。

圖5 化合物a對A549細胞凋亡的影響 (A)和(C)AnnexinV染色法檢測A549細胞凋亡水平；(B)和(D)檢測細胞凋亡信號通路

3 討論

萘醌類衍生物具有良好的抗腫瘤活性，實驗通過MTT法明確化合物a對A549細胞很強的生長抑制作用，它可以使A549細胞發(fā)生G0/G1期的細胞周期阻斷，并隨著處理時間的延長有部分細胞會發(fā)生凋亡；從時間的先后順序以及細胞周期的結(jié)果可以看出，化合物a先導(dǎo)致細A549細胞發(fā)生細胞周期阻滯，隨著處理時間的延長，細胞無法突破細胞周期阻滯隨后發(fā)生了細胞凋亡。A549細胞會大量的表達細胞周期相關(guān)蛋白使其突破細胞周期的限制快速增殖，而化合物a通過p21抑制周期相關(guān)蛋白質(zhì)的活性使細胞周期發(fā)生阻滯，但相關(guān)細胞周期蛋白代償性的表達量增多，因此可以看出化合物a可抑制細胞增殖?；衔颽值得進一步修飾，并在多種腫瘤細胞上評價其抗癌活性。

化合物b在相同的濃度下沒有表現(xiàn)出對A549細胞的抑制作用，說明2位的胺基大幅降低了該化合物對A549細胞的細胞毒性，這是也非常有意義的發(fā)現(xiàn)。首先，這兩種化合物結(jié)構(gòu)非常相似，不同之處只在于2位的取代基，這一發(fā)現(xiàn)可以給今后的萘醌類衍生物修飾提供理論依據(jù)；其次，雖然化合物b對A549細胞沒有增殖抑制作用，因為沒有毒性可在其它領(lǐng)域如抗炎、抗老化方面檢測活性，做進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，化合物a能夠激活P53和MAPKs信號通路導(dǎo)致A549細胞G0/G1期的細胞周期發(fā)生周期阻滯，進一步誘導(dǎo)凋亡，抑制了A549細胞增殖。化合物b在相同濃度下沒有抑制A549細胞增殖的作用，說明萘醌2-位的巰基取代相對于氨基取代顯示較好的抗癌活性。此結(jié)論為萘醌類衍生物的構(gòu)效關(guān)系研究提供了重要的理論依據(jù)，為萘醌類衍生物抗腫瘤藥物的篩選與合成提供了新的思路。