低溫預(yù)處理對百子蓮體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響及生理機(jī)制研究

岳建華，張夢帥，董 艷，張 燕，張 華，張 琰

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院 園藝學(xué)院，河南 信陽 464100； 2.信陽市大別山區(qū)園藝植物遺傳改良重點實驗室，河南 信陽 464100; 3.信陽農(nóng)林學(xué)院 林學(xué)院，河南 信陽 464100)

百子蓮(Agapanthuspraecoxssp.orientalis)為多年生單子葉草本花卉，原產(chǎn)非洲南部，花姿優(yōu)美，抗性極強(qiáng)，可做切花、盆栽、花壇、花境及地被應(yīng)用，并有“愛情花”的美譽(yù)，具有較大的推廣前景[1]。百子蓮引入我國后，其花芽分化[2-3]、株型調(diào)控[4-5]、抗性基因[6]已有較系統(tǒng)的研究。因其引種后不易結(jié)實[2-3]，目前繁殖方式以分株為主，但增殖系數(shù)低，而其花前成熟期偏長，約3～4 a，限制了這一優(yōu)良種質(zhì)資源的推廣[7]。

植物組織培養(yǎng)，尤其是體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic embryogenesis，SE)成為百子蓮快繁的重要途徑。自SUZUKI等[8]初步建立百子蓮SE再生體系之后，國內(nèi)研究者進(jìn)行了后續(xù)技術(shù)研發(fā)，但由于植物體胚發(fā)生機(jī)制仍是未解之謎[9]，目前效率依然偏低，百子蓮SE途徑仍未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

植物SE最早從細(xì)胞全能性(Cell totipotency)理論中衍生出來[9]，來源于非合子細(xì)胞，自胡蘿卜(Daucuscarota)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)等雙子葉植物成功進(jìn)行SE誘導(dǎo)后，目前唐菖蒲(Gladiolushybridus)、紅姜花(Hedychiumcoccineum)和朱頂紅(Hippeastrumhybridum)等單子葉觀賞植物均已成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，但普遍存在成胚效率偏低的問題[10-12]。

高效體胚誘導(dǎo)體系的優(yōu)化研究主要集中在培養(yǎng)基組分如植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源的改良等方面。激素信號平衡顯著影響植物體胚發(fā)生效果[13]，植物離體細(xì)胞、組織對激素類別、用量的響應(yīng)較為特異[14]。糖源通過提供能量，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓影響體胚發(fā)生，但不同植物對碳源種類、用量的需求不盡相同[9,13]，例如多數(shù)植物最佳碳源為蔗糖，而麥芽糖利于歐洲云杉(PiceaabiesL.Karst)成熟胚誘導(dǎo)[15]。因此，系統(tǒng)地進(jìn)行植物SE體系培養(yǎng)基組分的優(yōu)化是一項繁瑣的工作，此外，不同基因型、材料狀態(tài)、發(fā)育程度對培養(yǎng)基的要求又具有特異性[13,16]。目前有研究報道低溫預(yù)處理可有效提升離體培養(yǎng)效果，操作簡便，效果明顯[16-17]，對一些植物離體培養(yǎng)具有促進(jìn)效果，例如黑麥(SecalecerealeL.)[16]、展松(Pinuspatula)[18]、寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)[19]等。但相關(guān)研究針對體胚誘導(dǎo)關(guān)鍵期的報道較少，其生理機(jī)制的研究更是鮮見報道。

百子蓮SE技術(shù)體系有較大的提升空間，目前關(guān)于低溫預(yù)處理及其生理機(jī)制的研究未見報道。鑒于此，以胚性愈傷組織(Embryogenic callus，EC)為試材，采用低溫預(yù)處理方式優(yōu)化體胚發(fā)生體系；同時，通過內(nèi)源激素、糖代謝、氧化脅迫等體胚發(fā)生相關(guān)生理指標(biāo)的測定，初步揭示低溫預(yù)處理對百子蓮體胚發(fā)生的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，為百子蓮SE體系的改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

百子蓮種苗購自南京市彩虹花卉公司，栽植于信陽農(nóng)林學(xué)院校內(nèi)實驗基地。2017年5—6月份，選取5年生植株即將開裂的小花苞，切取小花梗作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷組織每月繼代1次，7～9個月后，得到單細(xì)胞起源的EC，繼代6個月后用于試驗研究。選取的EC狀態(tài)一致，生長旺盛，顏色鮮黃，結(jié)構(gòu)疏松。

1.2 試驗方法

將EC接種到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂)上，pH值5.8，121 ℃高壓滅菌25 min，60 ℃左右于超凈工作臺內(nèi)分裝至90 mm×16 mm玻璃培養(yǎng)皿，每培養(yǎng)皿25 mL，冷卻至室溫后接種，每培養(yǎng)皿接種1.0 g試驗材料，平均分為7份。每處理含5培養(yǎng)皿材料，設(shè)3次重復(fù)。在4 ℃低溫下預(yù)處理0、2、4、6 d，黑暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度(25±2)℃，相對濕度65%，光照強(qiáng)度為50 μmol/(m2·s)。

1.4 觀察及計數(shù)

培養(yǎng)30 d后，以形態(tài)完整，尺寸大于1 mm的不透明狀體胚計數(shù)，統(tǒng)計每團(tuán)EC產(chǎn)生的體胚數(shù)量。

1.5 生理指標(biāo)測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定糖類、激素、活性氧含量與保護(hù)酶活性等生理指標(biāo)[20]，委托上海酶聯(lián)生物科技有限公司測定。方法如下：稱取1.0 g鮮樣，加2 mL樣品提取液，冰浴勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL試管；4 ℃提取上清，過C-18固相萃取柱；轉(zhuǎn)入5 mL離心管，真空冷凍干燥，用樣品稀釋液定容；加標(biāo)樣及待測樣，取標(biāo)樣稀釋為梯度濃度(含0 ng/mL)，標(biāo)樣及待測樣加入96孔酶標(biāo)板，每孔50 μL，樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)；加一抗，將酶標(biāo)板置入37 ℃濕盒內(nèi)，30 min后洗板，洗滌4次。加二抗，放入濕盒內(nèi)，置于37 ℃ 30 min。洗板后加底物顯色，每孔加50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀上依次測定標(biāo)準(zhǔn)物梯度濃度和各樣品490 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品含量或酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016、GraphPad Prism 5、Adobe Acrobat Pro DC、Adobe Photoshop進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行顯著性檢驗(Duncan法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫預(yù)處理時間對百子蓮體胚誘導(dǎo)數(shù)量的影響

如圖1所示，低溫預(yù)處理時間對體胚誘導(dǎo)數(shù)量有顯著影響。不作低溫預(yù)處理情況下，每團(tuán)細(xì)胞產(chǎn)生體胚數(shù)量為11.19個，低溫預(yù)處理2、4、6 d后，體胚數(shù)量分別為18.33、9.24、2.71個，其中低溫預(yù)處理2 d對體胚誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，體胚數(shù)量比對照顯著增加63.81%(P<0.05)；低溫處理4 d時，體胚數(shù)量降低17.43%；處理6 d后，體胚數(shù)量顯著下降75.78%(P<0.05)。以上結(jié)果表明，低溫預(yù)處理可以顯著影響體胚誘導(dǎo)效果，處理2 d對百子蓮體胚發(fā)生具有促進(jìn)作用，處理4 d以上對體胚誘導(dǎo)不利。

A.低溫預(yù)處理時間影響體胚誘導(dǎo)的形態(tài)分析；B.低溫預(yù)處理時間影響體胚誘導(dǎo)數(shù)量的差異分析；標(biāo)尺為1 cm，n=3,不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同A.Morphological analysis of somatic embryo induction regulated by cold pre-treatment time;B.Difference analysis of somatic embryo induction number regulated by cold pre-treatment time;bar=1 cm,n=3,different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05),the same below圖1 低溫預(yù)處理時間對百子蓮體胚誘導(dǎo)數(shù)量的影響Fig.1 Effects of cold pre-treatment time on somatic embryo induction number in A.praecox

2.2 低溫預(yù)處理時間對百子蓮內(nèi)源激素代謝的影響

圖2結(jié)果表明，低溫預(yù)處理對百子蓮體胚誘導(dǎo)期內(nèi)源激素含量有不同影響。生長素類(圖2A、2B、2C)、赤霉素(GA)類(圖2D、2E、2F、2G)含量與體胚數(shù)量具有相似的變化規(guī)律，IAA、結(jié)合態(tài)IAA、GA含量均為單峰曲線變化，趨勢與體胚數(shù)量變化規(guī)律一致，其中低溫預(yù)處理2 d的GA1、GA3含量及IAA氧化酶活性顯著高于對照(P<0.05)。由圖2H可知，經(jīng)低溫預(yù)處理后細(xì)胞分裂素(CTK)含量逐漸降低，且均低于對照，表明低溫預(yù)處理時間對CTK含量的影響較大，且具有梯度效應(yīng)；油菜素內(nèi)酯(BR)含量變化幅度較小，各處理差異不顯著，整體變化趨勢與體胚數(shù)量變化規(guī)律相反(圖2I)；低溫處理2 d體胚組織內(nèi)ABA含量較低，而處理4、6 d，ABA含量相對較高，與體胚數(shù)量的規(guī)律相反(圖2J)。乙烯、茉莉酸(JA)含量呈波動變化，其中低溫處理2、6 d后，乙烯含量比對照顯著增加，JA含量則顯著降低(圖2K、2L，P<0.05)。綜上，生長素、GA及CTK含量受低溫預(yù)處理的調(diào)節(jié)較明顯，其中CTK的變化具有梯度效應(yīng)。

圖2 不同低溫預(yù)處理時間對百子蓮體胚誘導(dǎo)期內(nèi)源激素含量的影響Fig.2 Effects of cold pre-treatment time on endogenous hormone contents in somatic embryo induction stage

2.3 低溫預(yù)處理時間對百子蓮糖代謝的影響

糖代謝顯著受到低溫預(yù)處理的調(diào)節(jié)(圖3)。由圖3A可知，低溫預(yù)處理2、4、6 d，總糖含量比對照分別顯著增加31.44%、23.88%、28.75%(P<0.05)；淀粉含量和體胚數(shù)量趨勢一致，并隨處理時間呈梯度變化，其中處理2、4 d，含量比對照分別顯著增加51.91%、26.41%(P<0.05)(圖3B)；蔗糖含量的變化也呈現(xiàn)梯度效應(yīng)，但與體胚數(shù)量變化趨勢相反，其中處理2 d，體胚組織內(nèi)蔗糖含量顯著降低29.18%(P<0.05)(圖3C)；圖3E所示，處理2 d，麥芽糖含量顯著增加36.50%(P<0.05)；由圖3D、3F可知，體胚組織內(nèi)葡萄糖和果糖含量受低溫預(yù)處理的影響相對較小。綜上，總糖、淀粉、蔗糖及麥芽糖含量顯著受到低溫預(yù)處理時間的影響，其中淀粉、麥芽糖含量和體胚誘導(dǎo)數(shù)量的一致性較強(qiáng)。

2.4 低溫預(yù)處理時間對百子蓮氧化脅迫的影響

低溫預(yù)處理時間對活性氧及保護(hù)酶活性具有顯著影響(圖4)。活性氧(ROS)活性隨低溫預(yù)處理時間的增加而逐漸降低，且具有梯度變化(圖4A)；·OH含量在低溫預(yù)處理2 d的處理中達(dá)到較高水平(圖4B)；H2O2含量和過氧化物酶(POD)活性變化趨勢相同，且均具有梯度效應(yīng)，低溫預(yù)處理2 d使H2O2含量比對照顯著減少25.35%，POD活性比對照顯著降低18.41%(圖4C、4D，P<0.05)；低溫預(yù)處理后，過氧化氫酶(CAT)活性略有增強(qiáng)，呈單峰曲線變化，其中處理4 d的CAT活性最高(圖4E)；超氧化物歧化酶(SOD)活性呈波動變化，處理2 d比對照顯著增加17.08%，而處理4 d比對照顯著降低30.70%(P<0.05)，處理6 d的處理又有所升高(圖4F)。綜上，低溫預(yù)處理可顯著改變氧化脅迫的平衡，對體胚誘導(dǎo)產(chǎn)生影響，其中H2O2含量和POD活性隨處理時間的變化具有梯度效應(yīng)，受到低溫處理的調(diào)節(jié)較顯著。

圖3 不同低溫預(yù)處理時間對百子蓮體胚誘導(dǎo)期糖代謝的影響Fig.3 Effects of different cold pre-treatment time on sugar metabolism in somatic embryo induction stage

圖4 不同低溫預(yù)處理時間對百子蓮體胚誘導(dǎo)期活性氧積累及保護(hù)酶活性的影響Fig.4 Effects of different cold pre-treatment time on ROS accumulation and protective enzyme activity in somatic embryo induction stage

2.5 低溫預(yù)處理下百子蓮各指標(biāo)的相關(guān)性分析

為分析低溫預(yù)處理對百子蓮體胚發(fā)生效果的影響，并揭示相關(guān)生理調(diào)節(jié)機(jī)制，將體胚誘導(dǎo)數(shù)量、生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表1)。僅顯示生理指標(biāo)與體胚誘導(dǎo)數(shù)量相關(guān)性較強(qiáng)(Pearson相關(guān)系數(shù)>0.700)的相關(guān)系數(shù)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，低溫預(yù)處理影響下，體胚誘導(dǎo)數(shù)量與生理指標(biāo)達(dá)到較高的相關(guān)水平(表1)。IAA、CTK含量與體胚數(shù)量的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到了0.880、0.705的較高水平。淀粉、蔗糖、麥芽糖與體胚數(shù)量的相關(guān)系數(shù)分別為0.786、-0.970、0.742，表明淀粉、麥芽糖等糖源利于體胚數(shù)量增加，而內(nèi)源蔗糖含量過高對體胚誘導(dǎo)不利?！H含量與體胚數(shù)量的相關(guān)系數(shù)為0.745，H2O2含量、POD活性與體胚數(shù)量的相關(guān)系數(shù)分別為-0.886和-0.993，其中POD活性與體胚數(shù)量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。各生理指標(biāo)之間也存在一定的相關(guān)性，可能產(chǎn)生相互影響。相關(guān)性分析表明，IAA、CTK、淀粉、麥芽糖含量提高可能促進(jìn)體胚數(shù)量，而較高的蔗糖含量、H2O2含量、POD活性對成胚不利。

表1 百子蓮體胚誘導(dǎo)階段體胚數(shù)量與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis between somatic embryo number and physiological index in somatic embryo induction stage

3 結(jié)論與討論

低溫預(yù)處理可以改變細(xì)胞壁與原生質(zhì)體間的物質(zhì)交換程度，通過影響基因表達(dá)改變細(xì)胞分裂及分化進(jìn)程，可有效提高體胚誘導(dǎo)數(shù)量[18]。隨處理時間增加，低溫預(yù)處理對離體培養(yǎng)的作用通常由促進(jìn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种?，例如小?TriticumaestivumL.)[17]、寧夏枸杞[19]等，本研究中4 ℃處理2 d可顯著促進(jìn)體胚誘導(dǎo)。本研究結(jié)果同時表明，低溫預(yù)處理可通過調(diào)節(jié)激素代謝、糖代謝、氧化脅迫強(qiáng)度影響百子蓮體胚誘導(dǎo)數(shù)量。

3.1 低溫預(yù)處理可通過調(diào)節(jié)激素代謝影響體胚發(fā)生

低溫預(yù)處理可以影響細(xì)胞內(nèi)源激素的變化，而激素間的平衡對植物發(fā)育至關(guān)重要[13-14,21-22]。張菊平等[23]發(fā)現(xiàn)低溫預(yù)處理可以影響IAA、ABA含量，使辣椒(Capsicumannuum)配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)為孢子體途徑。短期低溫處理使蝴蝶蘭(Phalaenopsisspp.)葉片、小麥花藥內(nèi)源IAA、GA含量增加，而ABA含量隨低溫脅迫強(qiáng)度增加而增加[22,24]，以上報道與本研究IAA、GA和ABA含量結(jié)果基本一致。LIU等[13]轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，IAA和ABA信號在楸(Catalpabungei)SE體系中具有關(guān)鍵作用。內(nèi)源激素對體細(xì)胞胚極性的建立和發(fā)育至關(guān)重要，尤其是內(nèi)源IAA的富集利于體胚發(fā)生[13,25]；本研究中，IAA含量小幅變化，趨勢與體胚數(shù)量基本一致。在體胚發(fā)生過程中，蛋白質(zhì)的合成加強(qiáng)，CTK可在翻譯水平上刺激蛋白質(zhì)合成[26]，并誘導(dǎo)IAA的生物合成[27]，本研究中IAA和CTK含量的相關(guān)系數(shù)為0.749，表明CTK和IAA在體胚發(fā)育過程中可能起著協(xié)同促進(jìn)作用，而CTK含量的梯度變化規(guī)律及其對體胚數(shù)量的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步分析。ABA可以降低DNA甲基化水平，促進(jìn)體胚發(fā)生的同步化[28]，從而促進(jìn)體胚數(shù)量的增加，但過量會導(dǎo)致胚胎敗育。以上結(jié)果為針對性調(diào)節(jié)培養(yǎng)基激素配比，從而促進(jìn)離體培養(yǎng)內(nèi)源激素信號的再平衡提供了啟示和參考[24]。

3.2 低溫預(yù)處理可通過調(diào)節(jié)糖代謝影響體胚發(fā)生

碳水化合物是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，不僅為細(xì)胞提供能量，也對滲透壓有著一定的調(diào)節(jié)作用[29]。低溫可通過影響內(nèi)源碳水化合物的種類、含量而影響細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程[22]。王國霞等[30]發(fā)現(xiàn)低溫處理可以增加油茶(Camelliaoleifera)可溶性糖含量，姜寒玉等[31]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫可以快速提升葡萄(Vitisvinifera)蔗糖含量，與本研究結(jié)果基本一致。淀粉的積累通常可作為體胚發(fā)生中的重要事件，淀粉在體胚發(fā)育過程中快速分解，為細(xì)胞分裂提供能量[9]，有研究表明，麥芽糖和淀粉的積累對成胚數(shù)量起到促進(jìn)作用，這些物質(zhì)的積累在體胚發(fā)育轉(zhuǎn)變期至關(guān)重要[15]。本研究中，總糖、淀粉、麥芽糖含量均在低溫預(yù)處理2 d的樣品中達(dá)到最高水平，為體胚發(fā)育提供了充足的能量儲備。

3.3 低溫預(yù)處理可通過調(diào)節(jié)氧化脅迫平衡影響體胚發(fā)生

通常情況下，短暫的低溫預(yù)處理可以提高抗氧化酶類和抗性蛋白的表達(dá)[21,30]。小麥、油茶在經(jīng)受低溫脅迫后，POD、CAT和SOD等抗氧化酶活性上升[21,30]，與本研究結(jié)果基本一致。植物細(xì)胞在受到低溫等脅迫的情況下會增加ROS的產(chǎn)生，如H2O2和·OH[32]，對蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和脫氧核糖核酸代謝造成損害，最終導(dǎo)致氧化脅迫[33]?！H是活性氧最有害的形式，會引起DNA損傷[32]，而H2O2被認(rèn)為會影響到基因的表達(dá)，是非生物脅迫最重要的信號分子之一[34]。植物中的活性氧解毒過程對于保護(hù)植物細(xì)胞及其細(xì)胞器免受影響至關(guān)重要。隨低溫處理時間加長，植物細(xì)胞體內(nèi)H2O2含量增多，細(xì)胞自身會做出一些應(yīng)激反應(yīng)，比如POD等保護(hù)酶活性的增加[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，適度的低溫預(yù)處理可通過提升保護(hù)酶活性而影響體胚發(fā)生效果。

綜上，低溫預(yù)處理可提升百子蓮體胚誘導(dǎo)數(shù)量，其中4 ℃處理2 d效果較好，比對照顯著增加63.81%(P<0.05)，隨處理時間增加，體胚誘導(dǎo)效果由好轉(zhuǎn)差。4 ℃處理2 d可促進(jìn)IAA、GA等激素和淀粉、麥芽糖等糖源的富集，對百子蓮體胚誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用；而H2O2含量增加、POD活性的增強(qiáng)，表明氧化脅迫加劇，對體胚誘導(dǎo)不利。