商用益生芽孢桿菌的安全性分析

劉 純，方 瑩，龍 祝，胡 佳，郭小華

（中南民族大學生命科學學院，武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074）

芽孢桿菌是一類可以通過抗菌作用、生物奪氧等機制來保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡的有益微生物[1]，因此廣泛應用于人類膳食補充劑和動物飼料添加劑。目前關于益生芽孢桿菌選育的研究大多以菌的體內體外益生特性為主[2]，較少系統(tǒng)關注芽孢桿菌安全性方面的問題。作為活菌使用，因其“溢出效應”，不僅會對機體構成安全性風險，還會導致潛在的致病性芽孢桿菌擴散到環(huán)境中，對公眾健康造成危害[3]。芽孢桿菌的安全性風險主要包括耐藥性以及潛在腸毒性，已經有許多關于芽孢桿菌對抗生素表現(xiàn)出耐藥性并且其耐藥基因由質粒編碼的報道[1,4]。此外，益生芽孢桿菌具有產生腸毒素和嘔吐毒素等代謝產物的可能性，會導致宿主產生腹瀉及嘔吐等不良反應，在蠟樣芽孢桿菌作為益生菌應用時該問題尤為突出。應引起重視的是，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌雖然一直被認為是“公認安全（GRAS）”的菌種，但在前期報道中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)這兩類芽孢桿菌也會產生腸毒素，存在潛在安全性風險[5]。本研究以6種商用微生態(tài)菌劑中的6株芽孢桿菌為研究對象，從藥敏分析、耐藥性質粒、耐藥性基因和毒力基因的檢測等方面來系統(tǒng)評估其安全性，為藥用或者動物用益生芽孢桿菌的菌種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 以市售的6種商用微生態(tài)制劑樣品為基礎，其標識所包含的芽孢桿菌分別為2種枯草芽孢桿菌、2種蠟樣芽孢桿菌、2種地衣芽孢桿菌（為避免不必要的商業(yè)糾紛，在此隱去商品名；僅作為學術探討用材料），本試驗中分別命名為枯草芽孢桿菌的S-1和S-2、地衣芽孢桿菌的L-1和L-2、蠟樣芽孢桿菌的C-1和C-2，對市售樣品進行芽孢桿菌純種分離和16S rDNA鑒定確認。分離的菌種置于20%甘油凍存管中-80℃保藏。菌株活化時，將保藏的菌種在LB培養(yǎng)基上劃線得到單菌落，挑取單菌落接種到LB斜面培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后于4℃冷藏備用。

1.2 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉5 g，pH為7.0左右；需要配制成固體LB培養(yǎng)基時，則在液體中加入1.5%的瓊脂。

1.3 主要試劑和儀器 抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；AxyPrep質粒DNA小量試劑盒購自Axygen（杭州）；細菌基因組抽提試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；核酸濃度測定儀NanoDrop購自Thermo Fisher Scientific有限公司；PCR擴增儀T100TMThermal Cycler購自BIO-RAD；DNA Marker DL15000、DL5000、DL2000均購自TaKaRa（大連寶生物）；DYY-6C型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；JS-2012凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司。

1.4 芽孢桿菌藥敏分析 選擇四環(huán)素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氯霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素9種常用的抗生素進行藥敏分析。分別取100 μL芽孢桿菌菌懸液涂布在LB平板培養(yǎng)基上，用鑷子將不同抗生素試紙平貼于平板上，輕壓使藥敏紙片與培養(yǎng)基表面完全接觸，37℃倒置培養(yǎng)12 h左右，通過測量抑菌圈直徑判斷各個菌株對于不同抗生素敏感性。每種藥敏紙片進行3組平行試驗，抑菌圈直徑的測定基于3個平行試驗的平均值。

1.5 細菌基因組DNA提取 從各菌株斜面上刮取一環(huán)菌體分別接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后，按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 質粒的檢測 參照甘永琦等[6]方法，將藥敏試驗結果中的耐藥菌株接種于LB培養(yǎng)基，并選擇含質粒PET-28a的大腸桿菌和不含質粒TOP10的大腸桿菌分別作為陽性對照和陰性對照，37℃搖床過夜培養(yǎng)，采用少量質粒提取試劑盒提取質粒，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒存在與否。

1.7 耐藥基因的檢測 采用Adimpong等[7]方法，以藥敏試驗分析結果中耐藥菌株的DNA為模板，根據(jù)特定的引物分別特異性擴增相關耐藥基因ermA、ermB、ermC、msrA/B、ermD/K1a、ermD/K2a，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，以判定有無特異性目的條帶。引物信息見表1。

1.8 毒力基因的檢測 采用Guinebretière等[8]與Tompkins等[9]方法，以6株芽孢桿菌的DNA為模板，根據(jù)特定的引物分別特異性擴增hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、bceT和ces10種毒力基因，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，以判定有無特異性目的條帶。引物信息見表2。

2 結果與分析

2.1 各菌株抗生素敏感性測試 如表3所示，這6株芽孢桿菌對大多數(shù)抗生素表現(xiàn)出敏感性，只有2株地衣芽孢桿菌的L-1和L-2表現(xiàn)出對紅霉素耐藥性。

2.2 耐藥菌株中的耐藥基因定位檢測 根據(jù)表3的結果，進一步對地衣芽孢桿菌L-1和地衣芽孢桿菌L-2的紅霉素耐藥基因進行定位，其質粒提取結果如圖1，2株地衣芽孢桿菌菌株未檢測到質粒條帶，表明它們均不含有質粒，耐藥基因不是質粒所編碼。

以地衣芽孢桿菌L-1和地衣芽孢桿菌L-2的DNA為模板進行的紅霉素耐藥性基因PCR鑒定結果見圖2，2株地衣芽孢桿菌均在染色體上攜帶有ermD/K1a（814 bp）1種紅霉素耐藥基因，未攜帶ermA、ermB、ermC、msrA/B和ermD/K2a5種紅霉素耐藥基因。

2.3 各菌株毒力基因檢測 對6株芽孢桿菌分別進行常見的特異性毒力基因PCR鑒定膠圖如圖3，最終的檢測結果匯總到表4中。2株蠟樣芽孢桿菌均攜帶hblA（1 154 bp）、hblB（2 684 bp）、hblC（740 bp）、hblD（829 bp）、nheA（755 bp）、nheB（743 bp）和nheC（683 bp）7種腸毒素基因，2株地衣芽孢桿菌均攜帶hblD（829 bp）、nheC（683 bp）2種腸毒素基因，枯草芽孢桿菌S-1攜帶hblD（829 bp）、nheC（683 bp）和cytK（809 bp）3種腸毒素基因，枯草芽孢桿菌S-2只攜帶hblD（829 bp）1種腸毒素基因（圖3）。

表1 紅霉素耐藥基因引物信息[7]

表2 毒力基因引物信息[8-9]

3 討論

益生菌的耐藥性、是否產毒素是判定其安全性的2個重要方面[10]。已有研究證實，芽孢桿菌可通過接合或者以質粒的形式將耐藥基因傳遞給其他細菌。Agers? 等[11]在蠟樣芽孢桿菌中檢測到四環(huán)素耐藥基因tet（M）的存在，并能轉移至枯草芽孢桿菌和腸球菌，可造成耐藥性的傳播。Dai等[12]在枯草芽孢桿菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的案例，菌株質粒中攜帶四環(huán)素耐藥基因tet（K），并可以轉移至大腸桿菌。因此，在選用益生菌生產活菌制劑時，必須考慮是否具有耐藥基因轉移的風險。關于耐藥性的一個重要要求就是益生菌不得含有編碼耐藥性基因的質粒[13]。在前期類似研究中，Sorokulova等[14]報道的地衣芽孢桿菌BL31具有對氯霉素和克林霉素的耐藥性，但其不存在耐藥質粒。李雪龍等[15]報道的地衣芽孢桿菌的耐藥性基因也是由染色體編碼。本研究中，6株益生芽孢桿菌中只有地衣芽孢桿菌L-1和L-2對紅霉素有耐藥性，耐藥基因定位分析表明這2株地衣芽孢桿菌均不含有質粒，因而不具有通過質粒進行耐藥性基因傳播的可能性。本研究進一步確定了2株地衣芽孢桿菌產生的耐藥性均是由在染色體上的一種紅霉素耐藥性ermD/K1a基因引起的，這種結果與Gryczan等[16]報道的地衣芽孢桿菌所具有的耐藥性抗性基因一致。這些結果表明，大多數(shù)地衣芽孢桿菌的紅霉素耐藥性表型與ermD/K基因有關[17]。但這種基因也有可能編碼在質粒上，如Adimpong等[7]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌攜帶的ermD/K基因就是由質粒所編碼。因此，在新選育的益生芽孢桿菌中，如果選育得到良好性能的芽孢菌株具有耐藥性，一定要進一步做耐藥性的基因定位，只有染色體基因編碼的菌株才能保證益生菌的安全性。

益生芽孢桿菌中是否存在毒力基因并表達并產生毒素是安全性評價的另一重要方面。蠟樣芽孢桿菌中可能含有腸毒素和嘔吐毒素，這些毒素也可能存在于其他種的芽孢桿菌中[18-19]。與腸毒素相關的主要毒力基因有4個[8]，分別為溶血素Hbl、非溶血性腸毒素Nhe、細胞毒素K（CytK）、腸毒素T（BceT），其中編碼溶血素Hbl的基因由1個操縱子組成，包括hblA、hblB、hblC和hblD4個基因，需要hblA、hblC和hblD3個基因均表達時才會產生溶血素。編碼非溶血性腸毒素Nhe的3個組分的基因分別是nheA、nheB和nheC，這3個基因共表達時毒性最大。細胞毒素K具有細胞毒性，由cytK基因編碼[20]。腸毒素T由bceT基因編碼，已有研究證實腸毒素T沒有生物活性，可能不參與腸毒性危害[21]。嘔吐毒素主要由ces基因編碼，它具有抗酸性環(huán)境，抗蛋白水解酶裂解及耐熱的特點，危害較大。在前期芽孢桿菌安全性研究中，文英會等[22]在分離自飼料添加劑的蠟樣芽孢桿菌中檢測出嘔吐毒素基因ces，Duc等[23]在來自于Bactisubtil、BiostudylDL和Subtyl益生菌制劑中的蠟樣芽孢桿菌中均檢測到hbl和nhe的腸毒素基因。Ahaotu等[24]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌B13b和蠟樣芽孢桿菌A1均攜帶hbl和nhe基因。Stenfors[25]對26株蠟樣芽孢桿菌的毒力基因nhe、hbl、bceT、cytK進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)所有菌株都至少攜帶1個毒力基因；進一步的細胞毒性試驗發(fā)現(xiàn)其中有17株菌可以產生毒素。類似的結果也出現(xiàn)在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中，Rowan等[26]在分離自奶粉中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中檢測到了編碼HBL的4個基因，并在進一步腸毒性驗證結果中呈陽性。這些結果表明，芽孢桿菌攜帶毒力基因及產生毒素的幾率較大。本研究中使用的6株益生芽孢桿菌均表現(xiàn)為嘔吐毒素基因陰性，但所有菌株均檢測為腸毒素基因陽性。雖然陽性的腸毒性基因檢出并不意味著菌株一定產生腸毒性，需要結合具體的腸毒素進行進一步確認，但還是存在潛在的安全性風險，其中2株蠟樣芽孢桿菌攜帶編碼溶血素Hbl和非溶血性腸毒素Nhe的全部基因，其潛在安全性風險較其他4株菌株更大。需要注意的是，并非所有芽孢桿菌都攜帶毒力基因，Sorokulova等[14]在微生態(tài)制劑Biposporine?中的枯草芽孢桿菌BS3和地衣芽孢桿菌BL31均沒有到檢測hbl、nhe、bceT和cytK基因。因此，為了確保益生芽孢桿菌的使用安全，在對菌株選育時，一定要對其進行安全評估，對常見的毒力基因做廣泛性篩查，并盡可能減少攜帶腸毒性基因的菌株使用。若候選菌株益生性能優(yōu)良，需要根據(jù)陽性基因的檢出情況，再對毒素的活性作進一步確認，以確保益生菌的使用安全。

表3 6株商用芽孢桿菌菌株對抗生素敏感性測試

表4 6株商用芽孢桿菌菌株的毒力基因檢測

4 結論

本試驗研究的6株益生芽孢桿菌均不存在無耐藥性風險，但在每個菌株均攜帶一種或多種腸毒素基因，存在潛在的安全性風險，提示在選育益生芽孢桿菌時均應對菌株的安全性進行系統(tǒng)性判定。