硫化氫對(duì)尿源性膿毒血癥腎細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

鄒 雄，陳 仙，唐亞純，王斌輝，廖國(guó)濤，許武軍

0 引 言

尿源性膿毒血癥指由于泌尿系統(tǒng)感染而引起的膿毒血癥[1]。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是膿毒血癥的嚴(yán)重并發(fā)癥[2]，其特點(diǎn)是病死率高且腎功能恢復(fù)差，并發(fā)腎損傷的膿毒血癥患者較單純膿毒血癥患者的預(yù)后明顯變差[3-4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5]。Girardot等[6]研究證明膿毒血癥時(shí)，腎的損害和腎組織細(xì)胞凋亡有直接的關(guān)系。

硫化氫(H2S)作為近年來(lái)繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子[7]，其具有廣泛的生物學(xué)作用，對(duì)腎[8]、神經(jīng)[9]、心臟[10-11]都具有一定的保護(hù)作用。本研究將探索H2S能否調(diào)控p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)、半胱氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid specific protease，Caspase3)的表達(dá)來(lái)影響腎組織細(xì)胞凋亡從而減輕膿毒血癥腎損害。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只健康雄性新西蘭兔購(gòu)自湖南太平生物科技有限公司，體重2.1～2.5 kg，一兔一籠，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及純凈水喂養(yǎng)，鐵籠邊放飼料槽及自由飲水管，濕度50%～60%，室溫20～25 ℃。

1.2 主要試劑與藥品及檢測(cè)儀器大腸埃希菌(ATCC 25922南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科)，NaHS溶液、DL-炔丙基甘氨酸(DL-Propargylglycine，PAG)溶液、p38MAPK試劑盒、Caspase3試劑盒均買自武漢純度生物有限公司，TUNEL凋亡試劑盒(上海生工)、光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica)、熒光顯微鏡(上海萬(wàn)衡)、分光光度計(jì)(INESA)、血細(xì)胞分析儀(庫(kù)貝爾)、生化分析儀(西門子)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只新西蘭兔分成5組，每組8只。對(duì)照組：給予飼料以及純凈水喂養(yǎng)；假手術(shù)組：腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛(4 mL/kg)進(jìn)行麻醉，取左肋緣最低點(diǎn)作切口(3 cm)，在后腹腔找到左腎及輸尿管，游離輸尿管上段，依次縫合切口，術(shù)后正常喂養(yǎng)；膿毒血癥組：在假手術(shù)組的基礎(chǔ)上，用1號(hào)絲線結(jié)扎輸尿管遠(yuǎn)端，向輸尿管近端注入108/mL大腸埃希菌菌液(0.4 mL/kg)，制作膿毒血癥模型，依次縫合切口，術(shù)后正常喂養(yǎng)；NaHS組：手術(shù)方式及步驟與膿毒血癥組相同，縫合切口后按8.4 μmol/kg經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為50 mmol/L的NaHS溶液,促進(jìn)H2S產(chǎn)生；D-L炔丙基甘氨酸組(DL-Propargylglycine，PAG)組：手術(shù)方式及步驟與膿毒血癥組相同，縫合切口后按37.5 mg/kg經(jīng)腹腔注射濃度為50 mmol/L的PAG溶液,抑制H2S產(chǎn)生。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)生命體征：分別記錄術(shù)前、術(shù)后24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)5組新西蘭兔的肛溫、呼吸頻率、心率。血液相關(guān)指標(biāo)：分別在術(shù)前、術(shù)后24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)采取5組新西蘭兔的耳中動(dòng)脈血，用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀測(cè)血常規(guī)白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)其肌酐、尿素氮。

1.3.3 兔腎組織的HE染色法術(shù)后72 h取左腎組織進(jìn)行石蠟包埋切片后，采用羅氏全自動(dòng)HE染色儀對(duì)各組兔腎組織進(jìn)行HE染色。

1.3.4 術(shù)后72 h ELISA法檢測(cè)腎組織p38MAPK、Caspase3的含量嚴(yán)格按照兔p38MAPK、Caspase3定量酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A值)。分別以各自標(biāo)準(zhǔn)物的濃度作為Y軸，與之對(duì)應(yīng)的A值作為X軸，用Excel表計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，樣品的A值代入方程，計(jì)算出相應(yīng)的數(shù)值再乘以5得出待測(cè)樣品的濃度值。

1.3.5 TUNEL法檢測(cè)兔腎組織細(xì)胞凋亡情況步驟嚴(yán)格參照上海生工公司TUNEL染色試劑盒進(jìn)行；TUNEL染色后進(jìn)行DAPI復(fù)染，待DAPI染液凝固后，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在熒光顯微鏡下綜合DAPI染色和TUNEL染色計(jì)算高倍視野下(×400)黃綠色凋亡細(xì)胞占總的細(xì)胞比值。

2 結(jié) 果

2.1 新西蘭兔肛溫、呼吸頻率以及心率的比較假手術(shù)組術(shù)后24 h肛溫、呼吸頻率、心率較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。膿毒血癥組、NaHS組術(shù)后24 h、48 h、72 h的肛溫、呼吸頻率、心率較對(duì)照組、假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。NaHS組術(shù)后24 h、48 h、72 h的肛溫、呼吸頻率、心率較膿毒血癥組和PAG組明顯降低(P<0.05)。PAG組術(shù)后24 h、48 h、72 h的肛溫、呼吸頻率、心率較其余4組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 新西蘭兔血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較假手術(shù)組術(shù)后24 h白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較較對(duì)照組升高(P<0.05)。膿毒血癥組術(shù)后24 h、48 h、72 h的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較對(duì)照組和假手術(shù)組升高(P<0.05)。NaHS組術(shù)后24 h、48 h、72 h的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較膿毒血癥組和PAG組降低(P<0.05)。PAG組術(shù)后24 h、48 h、72 h的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較同時(shí)間點(diǎn)其余4組升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 新西蘭兔腎功能的比較膿毒血癥組、NaHS組、PAG組術(shù)后24 h、48 h、72 h肌酐、尿素氮較對(duì)照組和假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。NaHS組術(shù)后24 h、48 h、72 h肌酐、尿素氮較膿毒血癥組和PAG組明顯降低(P<0.05)。PAG組術(shù)后24 h、48 h、72 h肌酐、尿素氮較同時(shí)間點(diǎn)膿毒血癥組和NaHS組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表 1 新西蘭兔肛溫、呼吸頻率以及心率的比較

表 2 新西蘭兔血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

表 3 新西蘭兔腎功能的比較

2.4光學(xué)顯微鏡觀察HE染色腎組織病理變化對(duì)照組與假手術(shù)組的腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常；膿毒血癥組腎小球明顯萎縮，囊腔明顯擴(kuò)大，腎小管水腫明顯，可見(jiàn)壞死組織在腎小管管腔內(nèi)殘留，腎間質(zhì)中可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；NaHS組病理?yè)p害較膿毒血癥組明顯減輕；PAG組病理?yè)p害較膿毒血癥組和NaHS組明顯增強(qiáng)，且可見(jiàn)腎小球結(jié)構(gòu)被破壞，無(wú)法分辨腎小囊囊腔。見(jiàn)圖1。

2.5 TUNEL法檢測(cè)兔腎組織細(xì)胞凋亡情況對(duì)照組和假手術(shù)組兔腎組織凋亡細(xì)胞散在分布，2組的凋亡指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；膿毒血癥組腎組織凋亡細(xì)胞明顯集中成團(tuán)，凋亡細(xì)胞布滿整個(gè)視野，腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組與假手術(shù)組(P<0.05)；NaHS組兔腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)較膿毒血癥組明顯減少(P<0.05)，較對(duì)照組和假手術(shù)組明顯增多(P<0.05)，但NaHS組未見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯成團(tuán)；PAG組凋亡細(xì)胞較膿毒血癥組更加集中存在，PAG組細(xì)胞凋亡指數(shù)較膿毒血癥組和NaHS組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表4。

a：對(duì)照組；b：假手術(shù)組；c：膿毒血癥組；d：NaHS組；e：PAG組

圖示NaHS組細(xì)胞凋亡較膿毒血癥組、PAG組明顯降低

2.6 ELISA法檢測(cè)兔腎組織中p38MAPK、Caspase3蛋白的含量膿毒血癥組、PAG組腎組織中p38MAPK、Caspase3蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組、假手術(shù)組、NaHS組明顯升高(P<0.05)。PAG組術(shù)后腎組織中p38MAPK、Caspase3蛋白的表達(dá)量較膿毒血癥組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表 4 新西蘭兔腎組織中p38MAPK、Caspase3蛋白的表達(dá)量

3 討 論

本研究中，假手術(shù)組術(shù)后24 h的肛溫、呼吸頻率、心率、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較對(duì)照組升高，而術(shù)后48 h、72 h的肛溫、呼吸頻率、心率、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]原因?yàn)楦販?、呼吸頻率、心率、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的變化較肌酐、尿素氮靈敏；由于手術(shù)應(yīng)激引起假手術(shù)組術(shù)后24 h肛溫、呼吸頻率、心率、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的值較對(duì)照組升高，但由于解除了手術(shù)刺激，且假手術(shù)組無(wú)膿毒血癥的發(fā)生，術(shù)后48 h的肛溫、呼吸頻率、心率、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞又恢復(fù)正常；采用重復(fù)測(cè)量得出對(duì)照組、假手術(shù)組的各項(xiàng)指標(biāo)比較并無(wú)明顯差異，說(shuō)明手術(shù)刺激對(duì)兔的各項(xiàng)指標(biāo)并無(wú)明顯影響。與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，膿毒血癥組術(shù)后48 h肛溫、呼吸頻率、心率、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞進(jìn)一步升高，無(wú)緩解跡象，且腎功能進(jìn)一步損害，肌酐、尿素氮升高，綜合這些指標(biāo)以及一般情況，考慮尿源性膿毒血癥新西蘭兔模型建造成功；膿毒血癥組術(shù)后72h，精神狀態(tài)極差，肛溫、呼吸頻率、心率以及炎癥指標(biāo)白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞進(jìn)一步升高和腎功能情況進(jìn)一步惡化，且處死新西蘭兔后，發(fā)現(xiàn)其腎色澤暗淡，體積較正常腎明顯增大，且腎組織HE染色后高倍鏡下觀察，出現(xiàn)典型膿毒血癥AKI的病理改變。NaHS組術(shù)后各項(xiàng)指標(biāo)較膿毒血癥組明顯改善，PAG組術(shù)后各項(xiàng)指標(biāo)較膿毒血癥組和NaHS組進(jìn)一步惡化。因此考慮H2S對(duì)尿源性膿毒血癥新西蘭兔的一般情況、生命體征(肛溫、呼吸頻率、心率)、腎功能(肌酐、尿素氮)均有一定的改善作用。該結(jié)果與本研究前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12-13]基本一致。

細(xì)胞凋亡的過(guò)表達(dá)與多種蛋白表達(dá)增加相關(guān)，而p38MAPK、Caspase3是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的兩種蛋白。p38MAPK信號(hào)通路在缺氧、應(yīng)激以及內(nèi)毒素和炎癥因子存在的條件下可以被激活[14]，它與細(xì)胞的凋亡相關(guān)，且近年來(lái)被證實(shí)參與了腎組織細(xì)胞凋亡[15]，Zhou等[16]的研究進(jìn)一步證明p38MAPK的活化在膿毒癥過(guò)程中對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。Caspase3是哺乳動(dòng)物凋亡途徑的重要執(zhí)行者之一，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著舉足輕重的作用；研究表明，Caspase3的活化導(dǎo)致心肌細(xì)胞[17]、前列腺癌細(xì)胞[18]凋亡的增加，而抑制Caspase3的活性減少肝細(xì)胞以及腎組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。本研究中，對(duì)照組和假手術(shù)組術(shù)后72h兔腎組織中p38MAPK、Caspase3的表達(dá)較低，2組間p38MAPK、Caspase3表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；膿毒血癥組、NaHS組、PAG組3組兔腎組織中p38MAPK、Caspase3的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組、假手術(shù)組，說(shuō)明膿毒血癥的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致p38MAPK、Caspase3過(guò)度表達(dá)，這與Brent等[20]的研究報(bào)道一致；感染尿源性膿毒血癥的新西蘭兔注入NaHS，增加H2S生成后p38MAPK、Caspase3明顯減少，腎組織細(xì)胞凋亡減少，而注射PAG溶液抑制H2S的產(chǎn)生后，p38MAPK、Caspase3表達(dá)增加，腎組織細(xì)胞凋亡明顯增加，腎組織中p38MAPK、Caspase3的表達(dá)量和腎組織細(xì)胞凋亡成正相關(guān)，表明H2S可能通過(guò)抑制p38MAPK、Caspase3的表達(dá)來(lái)減少腎組織細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示H2S對(duì)尿源性膿毒血癥兔的腎功能具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與H2S抑制尿源性膿毒血癥腎組織中p38MAPK、Caspase3的表達(dá)從而減少腎細(xì)胞凋亡有關(guān)。