化聚消積方對肥胖伴高血壓大鼠早期腎損傷的影響

何燕銘，張?jiān)Y琳，文世梅，邵燕婷，王文健

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040；3.上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所，上海 200437

肥胖與高血壓作為代謝異常的代表性疾病，都是導(dǎo)致腎臟損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]。隨著生活水平的提高和生活方式的改變，臨床往往出現(xiàn)肥胖合并高血壓患者，這些患者因合并胰島素抵抗、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）亢進(jìn)等病理因素而引起微血管病變及后繼腎臟損傷可能性明顯增加。因此，改善肥胖伴高血壓導(dǎo)致的腎臟損傷具有重要的臨床意義。目前臨床較多使用血管緊張素受體抑制劑類藥物治療[3-4]，可降低尿微量白蛋白（microalbuminuria，MAU），但不能完全改善腎臟疾病進(jìn)展，仍存在相當(dāng)?shù)臍堄囡L(fēng)險(xiǎn)。前期臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，益氣散聚方可有效增加肥胖患者胰島素敏感性[5]，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化中藥復(fù)方化聚消積方可有效降低糖尿病腎病患者M(jìn)AU[6]。因此，本研究觀察化聚消積方對肥胖伴高血壓早期腎損傷的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量180～220 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)于溫度18～25 ℃、相對濕度50%～80%環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物

化聚消積方（黃芪30 g，黃連10 g，蒲黃15 g，澤瀉15 g，綠豆衣30 g，六月雪15 g，附子9 g，積雪草15 g），飲片購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房:常規(guī)加水煎煮、過濾，提取液合并，減壓濃縮至比重約為1.2（60 ℃），濃縮液靜置放冷，加乙醇至70%乙醇濃度，靜置過夜，吸取上清液，減壓回收乙醇，真空干燥，粉碎，得浸膏粉。浸膏粉制作由國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心完成，4 ℃保存，雙蒸水稀釋至所需濃度使用。纈沙坦膠囊，北京諾華制藥有限公司，規(guī)格80 mg/粒，批號X0320。灌胃前用雙蒸水配成相應(yīng)濃度溶液。

1.3 主要試劑與儀器

MAU ELISA 試劑盒（MyBioSource，批號MBS2022813 ）， SYBR Green supermix （ Takara Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China，批號DRR041A），血管緊張素Ⅱ 1 型受體（AT1R）一抗（ab124734，Abcam）、AT2R 一抗（ab92445，Abcam），二抗（馬抗兔ab6721，Abcam），DAB 染色試劑盒（碧云天公司，批號 P0203）。國產(chǎn)智能無創(chuàng)血壓計(jì)（Softron，型號BP-98A），酶標(biāo)儀（BioTek，型號Epoch），水浴鍋（Leica，型號HI1210），超低溫冰箱（Revco，型號ULT2586-4-V），實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Roche，型號LightCycler 480Ⅱ），石蠟切片機(jī)（Leica，型號RM2235），正置顯微鏡（Leica，型號DM2000）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模和給藥

SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d，隨機(jī)分為正常組10 只和高鹽高脂組30 只，正常組給予正常飲食喂養(yǎng)，高鹽高脂組給予高鹽高脂喂養(yǎng)（18%豬油、8%蛋黃粉、2%膽固醇、0.2%膽鹽、4%食鹽和67.8%普通飼料）。2 周后高鹽高脂組隨機(jī)分為模型組、陽性藥組及中藥組，每組10 只。給藥劑量按體表面積換算成臨床成人用藥量的6 倍，陽性藥組予纈沙坦藥液13.3 mg/kg灌胃，中藥組給予化聚消積方藥液8.13 g/kg 灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。每日1 次，給藥體積為2 mL，連續(xù)6 周，整體實(shí)驗(yàn)共8 周。實(shí)驗(yàn)過程中，正常組大鼠予普通飼料，其余各組大鼠均予高鹽高脂飼料。

2.2 標(biāo)本收集及處理

實(shí)驗(yàn)8 周后，代謝籠收集24 h 尿液。次日隔夜空腹12 h，戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，2500 r/min離心15 min，分離血清、血漿，置-20 ℃冰箱保存，取腎臟組織-80 ℃冰箱凍存，石蠟包埋，切片。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 體質(zhì)量、血壓及生化檢測套尾法檢測大鼠血壓，每2 周檢測1 次，平均動(dòng)脈壓（MAP）計(jì)算方法為舒張壓＋1/3 脈壓差。處死前常規(guī)檢測大鼠體質(zhì)量。ELISA 檢測大鼠MAU 水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀讀取OD 值。收集大鼠動(dòng)脈血，離心，獲取大鼠血清及血漿，置于-20 ℃冰箱保存。生化法檢測血清肌酐（Cr），放免法檢測血漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的水平。

2.3.2 腎臟組織常規(guī)染色及免疫組化檢測

和能量代謝，導(dǎo)致肥胖、高血壓等疾病，是典型的脾虛不化狀態(tài)。聚證不治，又可引起許多繼發(fā)病變，病久傷及脈道，絡(luò)瘀脈損，血運(yùn)蹇澀，腎絡(luò)瘀阻，邪濁留積，壅塞三焦，開闔不利，則出現(xiàn)腰痛、水腫、關(guān)格等。這些病證則屬聚證不治而致的“積證”范疇，相當(dāng)于在肥胖高血壓患者中常見的腎功能異常以致衰竭。因此，治療要宜及早，要在“化聚”基礎(chǔ)上“消積”[9-10]。治以攻補(bǔ)兼施、溫腎散積，治療“積證”，據(jù)此，王文健教授創(chuàng)立益氣化聚方，方中黃芪甘溫補(bǔ)中，推動(dòng)氣化，助脾散聚布精，為君藥；黃連苦寒，清熱、瀉火、燥濕，祛濕熱之邪，為臣藥；澤瀉甘寒，利水、滲濕、泄熱，助黃連清熱，熱隨濕去，邪去則清氣得生，濁氣得降，為佐藥；蒲黃味甘性微寒，血分藥而兼行氣分，上者可清，下者可利，滯者可行，為使藥。諸藥合用，既推動(dòng)氣化之功能，又消散滯留之病邪，使精微物質(zhì)能夠正常布散運(yùn)化。在此基礎(chǔ)上加溫腎清利消積中藥組成化聚消積方，治療代謝紊亂導(dǎo)致的腎臟慢性病變。

本研究結(jié)果顯示，化聚消積方可有效改善肥胖伴高血壓大鼠MAU，腎臟Renin、AngⅡ及AT1R 表達(dá)明顯降低，腎小管局部AT1R 及AT2R 蛋白表達(dá)明顯抑制。血液中檢測的循環(huán)RAS 相關(guān)指標(biāo)在各組間未見明顯異常，說明循環(huán)RAS 并未明顯激活。AngⅡ是一種活性很高的升壓物質(zhì)，可通過血管平滑肌、腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞、心、腦、腎等器官的細(xì)胞上血管緊張素受體產(chǎn)生作用[11-13]。經(jīng)8 周高鹽高脂飲食干預(yù)，模型組大鼠腎臟RAS 顯著激活，表現(xiàn)為腎臟AngⅡ、ACE、AT1R mRNA 表達(dá)顯著升高。而經(jīng)6 周藥物治療，陽性藥組與中藥組均顯著抑制腎臟RAS 的激活狀態(tài)，說明中藥治療對肥胖伴高血壓大鼠腎臟RAS有良好的調(diào)節(jié)作用。

腎小管局部RAS 在高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用舉足輕重，越來越受到研究者重視[14]。AngⅡ通過AT1R及AT2R 直接作用在腎小管，能影響腎小管特別是遠(yuǎn)曲小管在各種物質(zhì)重吸收的作用，進(jìn)而影響機(jī)體血壓變化，并進(jìn)一步影響各種靶器官的功能。但目前該途徑機(jī)理及干預(yù)的相關(guān)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腎小管AT1R 及AT2R 表達(dá)均明顯升高，說明RAS在腎小管局部的作用明顯增強(qiáng)。經(jīng)藥物干預(yù)后，各給藥組AT1R 及AT2R 表達(dá)均明顯降低，且明顯降低腎小管RAS 激活水平，這可能也是其有效降壓的機(jī)理之一，更深入的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。