百事樂膠囊對皮質酮暴露大鼠海馬神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)相關蛋白表達的影響

王華，凌佳，趙洪慶，3，藺曉源，王宇紅，3，孟盼，3

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；3.中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208

抑郁癥是最常見的嚴重精神障礙性疾病，具有睡眠障礙、缺乏興趣等核心價值降低的特點。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告顯示，全球現(xiàn)有抑郁癥患者約3.4 億，而中國作為全球抑郁癥人數(shù)最多的國家其發(fā)病率高達4.2%[1]。下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸是機體應激的調節(jié)系統(tǒng)，參與機體糖皮質激素的產生，并通過海馬中糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）完成其負反饋調節(jié)。血清和糖皮質激素誘導激酶1（serum and glucocorticoid-induced kinase 1，SGK1）

是糖皮質激素信號系統(tǒng)的下游靶點[2]。采用海馬神經(jīng)前體細胞聯(lián)合SGK1、GR 抑制劑，發(fā)現(xiàn)SGK1 是糖皮質激素降低海馬神經(jīng)元再生的下游位點；同時，SGK1 可能通過向下調節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）等神經(jīng)營養(yǎng)蛋白從而影響海馬神經(jīng)元再生[3]。重度抑郁癥患者外周血中SGK1 的表達明顯上升，進一步說明SGK1 與抑郁癥的發(fā)生密切相關[4]。百事樂膠囊由人參、貫葉連翹、姜黃組成，系具有獨立自主知識產權的抗抑郁中藥復方制劑，是根據(jù)中醫(yī)理論及國內外治療抑郁癥的研究成果及一定的科研基礎篩選擬定的臨床經(jīng)驗方。前期研究表明，百事樂膠囊可顯著改善慢性應激抑郁模型大鼠抑郁樣行為學表現(xiàn)[5]，促進模型大鼠海馬神經(jīng)再生[6]，并能顯著調節(jié)GR/SGK1 信號通路[7]。本實驗以皮質酮暴露大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，以SGK1 信號和神經(jīng)營養(yǎng)因子為切入點，進一步探究百事樂膠囊對海馬神經(jīng)元保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF 級SD 大鼠12 只，其中雌性（受孕18 d）3 只，體質量350～450 g，雄性9 只，體質量200～220 g，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號為SCXK（湘）2015-0003。其中雌性大鼠直接用于海馬神經(jīng)元原代取材，雄性大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF 級實驗動物中心。

1.2 藥物

百事樂膠囊，湖南省中醫(yī)藥研究院提供，0.38 g/粒，批號20140421；鹽酸氟西汀膠囊，20 mg/粒，Patheon France，批號0722A。

1.3 主要試劑與儀器

皮質酮、L-多聚賴氨酸、DMSO（美國Sigma 公司），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（美國Amresco 公司），DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone 公司），Neurobassal神經(jīng)元基礎培養(yǎng)基、B27添加劑、Glutamax（美國Gibco 公司），多聚甲醛（天津科密歐公司），兔抗烯醇化酶多克隆抗體（NSE）（中國Bioworld 公司），BDNF 多克隆抗體、NT-3 多克隆抗體、β-tublin多克隆抗體、DAPI、FITC 標記羊抗兔IgG、R-PE 標記羊抗小鼠IgG（英國Abcam 公司），神經(jīng)生長因子（NGF）多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。CO48R-230 型三氣細胞培養(yǎng)箱（New Brunswick Galaxy），OPERETTA 型高內涵成像分析系統(tǒng)（HCA，PerkinElmer），低溫離心機（Eppendorf），超低溫冰箱（青島海爾），IX71 型倒置熒光相差顯微鏡（日本Olympus），S8PAO 型體視顯微鏡（美國Leica）。

1.4 藥物血清制備

將SPF 級雄性SD 大鼠隨機分為百事樂膠囊藥物血清組、氟西汀藥物血清組和空白血清組，每組3 只，分別對應給予臨床有效3 倍量百事樂膠囊（4.32 g/kg）、鹽酸氟西汀膠囊（16.2 mg/kg）、蒸餾水，2 次/d，連續(xù)3 d，按10 mL/kg 灌胃給藥，末次給藥后1 h 于無菌條件下腹主動脈取血，暫存于促凝管中，靜置2 h，3000 r/min 離心15 min，吸取上清液，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm 濾膜過濾，分裝后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

GR/SGK1 信號通路參與學習、記憶和神經(jīng)可塑性以及應激反應和抑郁癥的發(fā)生[10]。持續(xù)應激狀態(tài)下HPA 軸激活，導致糖皮質激素持續(xù)分泌，損傷海馬神經(jīng)元內GR并引起HPA軸負反饋失衡后的神經(jīng)內分泌系統(tǒng)紊亂[11]。SGK1 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AGC亞家族成員，可參與細胞代謝、神經(jīng)興奮性、細胞增殖和凋亡及激素分泌等過程[12]。SGK1 在長時程記憶形成中扮演重要角色，SGK1 失活可損傷空間記憶及新事物的認知記憶[13]。研究表明，急性冷水游泳應激小鼠模型、反復注射皮質酮或地塞米松構建的抑郁樣小鼠模型腦內SGK1 的表達均明顯上調[14]。同時，抑郁癥患者SGK1 mRNA 水平升高，與慢性應激抑郁模型動物SGK1 表達趨勢相符[15]。SGK1 可通過糖皮質激素信號參與抑郁癥的發(fā)生，并在無糖皮質激素的條件下潛在維持GR 活性，可反饋調控GR 的磷酸化水平，即SGK1 是HPA 軸負反饋調節(jié)的核心樞紐[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，百事樂膠囊藥物血清可顯著降低皮質酮暴露海馬神經(jīng)元SGK1 的表達，與前期在體研究結果一致[7]，提示SGK1 是百事樂膠囊發(fā)揮良好抗抑郁功效的核心靶點之一。

BDNF、NT-3、NGF 是一類具有神經(jīng)營養(yǎng)功能的小分子蛋白，可促進神經(jīng)細胞存活，增加突觸可塑性，對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化及功能維持具有重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血清中BDNF 水平明顯低于健康人[18]，BDNF 基因敲除的小鼠表現(xiàn)出明顯的快感缺乏和探索能力下降等抑郁樣表現(xiàn)，且海馬內神經(jīng)元數(shù)目減少，樹突長度和分枝復雜度下降[19]。何國琪等[20]發(fā)現(xiàn)慢性應激大鼠腦內NT-3 的表達顯著下降，且伴隨著神經(jīng)元的凋亡。NGF 是神經(jīng)營養(yǎng)素的另一個重要組成蛋白，抑郁癥自殺者死后腦內NGF水平明顯低于正常對照組。抑郁模型大鼠特定腦區(qū)NGF 水平顯著降低，而給予氟西汀干預后NGF 水平顯著升高[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，皮質酮暴露條件下的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的樹突連接斷裂、神經(jīng)網(wǎng)絡復雜度降低等細胞損傷現(xiàn)象，并伴隨著BDNF、NT-3、NGF的相對熒光強度降低；給予百事樂膠囊藥物血清干預后，上述指標均有所逆轉，提示百事樂膠囊可提高皮質酮暴露海馬神經(jīng)元的可塑性，改善神經(jīng)營養(yǎng)丟失情況，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

腦為元神之府，腦主神明而總統(tǒng)諸神。神明，包括精神、意識、思維活動，這其中也包括情志活動。若氣血失調，元神失養(yǎng)，神機運轉不利，就會導致反應遲鈍、精神萎靡等抑郁癥狀的產生。百事樂膠囊是本課題組研發(fā)的抗抑郁中藥制劑，方中姜黃活血化瘀、行氣止痛，善破肝脾二經(jīng)之血瘀氣結，主血瘀氣滯諸證；貫葉連翹具有疏肝解的功效，為臣藥，取散諸結之意；人參大補元氣、安神益智。全方具有理氣活血、寧心安神功效。

基于抑郁癥“單胺神經(jīng)遞質”假說的藥物研發(fā)已成為目前抗抑郁的主流，但仍存在很大的限制。抑郁癥“海馬神經(jīng)可塑性障礙”假說可為抗抑郁藥物研發(fā)理論從傳統(tǒng)轉向新視野提供思路。圍繞神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)可塑性、HPA 軸等藥物作用的新靶標，從多環(huán)節(jié)、多途徑著手研發(fā)抗抑郁中藥復方將成為趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，百事樂膠囊可通過SGK1 信號改善神經(jīng)元的營養(yǎng)丟失、增加突觸可塑性，進而發(fā)揮抗抑郁功效。