mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的診斷效能評估

李 霞，譚少華，韓 孟，葉明欣，李少梅

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)感染性的急危重癥，具有潛在的致死性，并且在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率。其致病微生物眾多，包括細(xì)菌、病毒和真菌以及寄生蟲等，疾病的臨床表現(xiàn)往往呈現(xiàn)非特異性，如果不能及時識別其致病病原體并給予針對性的治療，則會導(dǎo)致患者的病情迅速發(fā)展為持續(xù)高熱、癲癇、昏迷甚至死亡。因此，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的診治過程中，病原體的明確起著至關(guān)重要的作用[1]。迄今為止，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷依然面臨著很大的挑戰(zhàn)，其臨床癥狀多種多樣，且感染癥狀與非感染癥狀常常發(fā)生重疊，給準(zhǔn)確診斷造成了很大困難。在既往的臨床診治過程中，臨床醫(yī)生只能通過腦脊液常規(guī)、生化、培養(yǎng)等結(jié)果判定患者可疑的病原體種類，2013年，美國C.Y.Chiu教授首次應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷了14歲小男孩的鉤端螺旋體腦病并挽救了他的生命，引起了全球神經(jīng)科醫(yī)生對mNGS技術(shù)在病原體檢測方面應(yīng)用的巨大興趣，并進(jìn)行了探索性研究[2]。近年來，既往的研究宏基因組測序在神經(jīng)系統(tǒng)感染中的應(yīng)用多以個案報道為主，依然不能評估m(xù)NGS在神經(jīng)系統(tǒng)感染中的診斷價值。本研究對疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染分別行腦脊液mNGS檢測和常規(guī)培養(yǎng)檢測，并對相關(guān)結(jié)果進(jìn)行對比分析，以明確mNGS可以為臨床神經(jīng)科感染性疾病的精準(zhǔn)治療提供可靠的工具，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月～2019年12月就診于我院的疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的39例患者為研究對象，男21例，女18例，年齡15～88歲，平均(39.9±5.7)歲。所有患者均簽署了知情同意書。根據(jù)2016年《細(xì)菌性腦膜炎診治指南》[3]，納入發(fā)熱、頭痛、癲癇、精神狀態(tài)改變、記憶力下降，腦膜刺激征陽性，或影像學(xué)提示腦炎腦膜炎的可能的患者。

1.2方法：觀察組行mNGS檢測：進(jìn)行樣本采集與mNGS檢測，每名患者采集約2～3 ml腦脊液樣本，并進(jìn)行無菌密封，于-20℃儲存或干冰冷鏈物流運輸至予果生物科技有限公司(中國,北京)，按照DNA提取、文庫構(gòu)建，在Illumina平臺上運行宏基因組二代測序，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先運用通過過濾掉原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量序列和短序列(長度<50 bp)得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，再運用SNAP軟件去除人類基因，最后通過Burrows-Wheeler同時與微生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而對序列分類，數(shù)據(jù)庫來源于NCBI，包括超過20 000種微生物，覆蓋了與人類疾病相關(guān)的11 910種細(xì)菌、7 103種病毒、1 046種真菌和305種寄生蟲的基因組。

對照組行常規(guī)培養(yǎng)檢測：采集約4～6 ml腦脊液樣本，將其接種在厭氧菌、需氧菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，控制二氧化碳濃度在6%～11%，溫度控制在35～36℃，18～24 h后進(jìn)行觀察，分析是否有增菌液渾濁現(xiàn)象或菌膜組織，提取培養(yǎng)液或菌膜，接種在血平板中，進(jìn)行病原體的分離培養(yǎng)，然后開展離心處理工作，涂片干燥之后，進(jìn)行革蘭染色鏡檢檢驗。

1.3觀察指標(biāo)：①診斷符合率：患者以患者急性起病，以頭痛、發(fā)熱、昏迷、抽搐、精神行為異常等為主要臨床表現(xiàn)，查體提示腦膜刺激征陽性，腦脊液壓力正?；蛏撸X脊液白細(xì)胞計數(shù)升高，臨床抗感染治療后有效，考慮診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染明確。統(tǒng)計觀察組mNGS陽性、陰性與臨床診斷相符合例數(shù)，對照組常規(guī)腦脊液培養(yǎng)陽性、陰性與臨床診斷相符合例數(shù)。②統(tǒng)計觀察組mNGS組和對照組常規(guī)腦脊液培養(yǎng)組靈敏度、特異度、一致性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均由SPSS 18.0軟件處理，計數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗及Fisher's 檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組診斷符合率比較：39例患者中，觀察組mNGS陽性、陰性與臨床診斷相符合總例數(shù)29例，對照組常規(guī)腦脊液陽性、陰性與臨床診斷相符合總例數(shù)13例，觀察組診斷符合率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.61，P<0.001)。

2.2兩組靈敏度、特異度、一致性：mNGS組有16例患者mNGS結(jié)果為陽性，靈敏度為61.54%，特異度100%，一致性為74.36%。常規(guī)腦脊液培養(yǎng)所有39例疑似病例均為陰性結(jié)果；常規(guī)腦脊液培養(yǎng)的靈敏度為0，特異度100%，一致性為33.3%。觀察組靈敏度、特異度、一致性均明顯高于對照組，見表1。

表1 兩組靈敏度、特異度、一致性比較(%)

3 討論

對入組的疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者的腦脊液進(jìn)行宏基因組檢測，以對mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷效能進(jìn)行評估。

既往對病原體的診斷較多的依靠腦脊液的常規(guī)、生化、培養(yǎng)、鏡檢，近年來還有基于PCR的病原特異性核酸檢測。但腦脊液的培養(yǎng)、鏡檢的陽性率比較低，無法早期或者超早期給與臨床指導(dǎo)，腦脊液的常規(guī)、生化經(jīng)常會受到患者的病程或者抗生素的應(yīng)用而產(chǎn)生非特異性的表現(xiàn)[4]。所以在臨床診治過程中，臨床醫(yī)生基本要綜合患者的臨床特點、腦脊液常規(guī)、生化結(jié)果進(jìn)行可能性的診斷，比如劃分為病毒性、細(xì)菌性、真菌性等，無法得到明確的病原體診斷，而對于少見的、罕見的病原微生物，更是無法精準(zhǔn)性的識別。

高通量測序技術(shù)又稱二代測序技術(shù)，具有檢測速度快、準(zhǔn)確率高、覆蓋面廣等特點，能很好地直接從臨床樣本(血液、腦脊液、肺泡灌洗液等)中識別罕見、新穎、難以檢測和共感染的病原體[5]，近年來研究者應(yīng)用mNGS技術(shù)陸續(xù)對人類皰疹病毒、偽狂犬病毒、囊蟲、弓形蟲等感染提供了的診斷依據(jù)[6-7]，并指導(dǎo)治療有效。在臨床研究中，mNGS技術(shù)提供了腦膿腫患者嗜血桿菌、腦炎患者的豬鏈球菌、水痘帶狀皰疹病毒、人類皰疹病毒6B、人類(伽馬)皰疹病毒第四型等病原體的精準(zhǔn)證據(jù)。

本研究中mNGS陽性共16例，靈敏度61.74%，特異度為100%。國外有研究也發(fā)現(xiàn)NGS有診斷特異度高、靈敏度低的特點，與本研究結(jié)果[8]一致。為綜合考慮靈敏度和特異度，我們使用ROC曲線對mNGS診斷能力進(jìn)行判斷，ROC曲線下面積(AUC)為0.81，說明mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的診斷能力較強(qiáng)。同腦脊液培養(yǎng)相比，我們使用綜合判別改善指數(shù)(IDI)來進(jìn)行說明，IDI是指新模型(NGS)和舊模型(腦脊液培養(yǎng))對于每個個體預(yù)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染發(fā)生概率之差，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IDI=0.35>0，說明mNGS預(yù)測感染性疾病的概率高于腦脊液培養(yǎng)，mNGS更準(zhǔn)確。本次研究定量的反映了mNGS的診斷能力，并與傳統(tǒng)腦脊液培養(yǎng)的診斷手段進(jìn)行了比較，用數(shù)據(jù)證明了mNGS為臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病更好的診斷手段。

但是，并非所有的患者均能得到陽性結(jié)果，本研究中分析原因可能為：①采樣環(huán)節(jié)造成的假陰性，如病原載量過低，采集到的病原低于檢測限，或者未取到感染部位的樣本；②儲存或運輸過程造成的假陰性，如未嚴(yán)格-20℃低溫凍存導(dǎo)致核酸降解；③實驗環(huán)節(jié)造成的假陰性，如真菌破壁效率較低，影響真菌檢出率；④數(shù)據(jù)庫不完善造成的假陰性，如新發(fā)病原體未包含在數(shù)據(jù)庫中，從而無法檢測出新發(fā)病原體；⑤mNGS方法學(xué)原理造成的假陰性，如人源序列比例過高，導(dǎo)致病原體測序序列數(shù)過低。同時我們還需要避免采樣環(huán)節(jié)如腰椎穿刺過程、標(biāo)本轉(zhuǎn)移過程的污染，實驗環(huán)節(jié)、測序環(huán)節(jié)的污染如實驗試劑、耗材、氣溶膠的污染、測序錯誤等。所以，得到mNGS數(shù)據(jù)后，我們還要綜合患者的臨床特點、腦脊液特性、測序序列數(shù)的情況進(jìn)行綜合分析，從而得到可靠的診斷結(jié)果，進(jìn)行精準(zhǔn)治療，改善患者預(yù)后。另外隨著技術(shù)進(jìn)步，如果更有效的工作流程，更低的檢測成本、快速周轉(zhuǎn)時間，以及簡化精確的解釋標(biāo)準(zhǔn)，mNGS將在臨床實踐中被廣泛接受。

綜上所述，相對于陽性率較低的病原微生物培養(yǎng)技術(shù)，mNGS技術(shù)通過分析樣本的病原微生物的序列信息，判斷出微生物的物種，具有高效、快速、精準(zhǔn)的優(yōu)勢，為我們臨床感染性疾病的診治提供有力的依據(jù)，對改善患者的臨床預(yù)后具有積極意義。