參附注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注期間的心電圖演變過程的影響及作用機(jī)制研究

鄧?guó)P珠,馮 沖,李春富,符海燕,李天發(fā)

(1.海南西部中心醫(yī)院心電圖室, 海南 儋州 570125； 2.海南西部中心醫(yī)院心內(nèi)科, 海南 儋州 570125；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科, 廣州 510080)

缺血性心臟病是臨床常見心血管疾病,其發(fā)病率和致死率均較高,臨床常見為急性心肌梗死、冠心病、心絞痛等[1]。 缺血性心臟病早期再灌注是其治療的重要手段之一,但在心肌恢復(fù)血流灌注過程中常出現(xiàn)繼發(fā)性損傷,易發(fā)生室性心動(dòng)過速( ventriculartachycardia, VT )、 心 室 顫 動(dòng)(ventricularfibrillation,VF)等并發(fā)癥,是導(dǎo)致缺血再灌注期間患者猝死的重要原因[2-3]。 因此,尋找毒副作用少、療效穩(wěn)定的藥物對(duì)減少心肌缺血再灌注損傷有重要意義。 參附注射液由中藥紅參、黑附片提取配置而成,具有改善微循環(huán)、提高機(jī)體缺氧耐受能力的作用。 目前,臨床已有關(guān)于參附注射液對(duì)心肌缺血再灌注損傷及心肌保護(hù)作用的報(bào)道[4],但關(guān)于其對(duì)心肌缺血再灌注損傷期間心電圖變化的影響及調(diào)控機(jī)制研究尚少。 本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型,探討參附注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注期間的心電圖演變過程的影響及作用機(jī)制,為參附注射液臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,50 只,10 周齡,體重200～240 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2018-0001]；動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)[SYXK(粵)2019-0209]；實(shí)驗(yàn)研究過程中做到了替代、減少、優(yōu)化的3R 原則,實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(IACUC20180901-1)。

1.2 主要試劑與儀器

參附注射液(華潤(rùn)三九(雅安)藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020664,規(guī)格10 mL,貨號(hào)180621)；TUNEL 檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche 公司, 貨號(hào):1884817)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa 公司,貨號(hào):D6110A)；二喹啉甲酸(diquinolinicacid,BCA)蛋白定量分析試劑盒(美國(guó)Thermo 公司,貨號(hào):23227)；兔抗鼠蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylatedAkt,p-Akt)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(phosphorylatedGSK-3β,p-GSK-3β)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapain target protein,mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)多抗(一抗,美國(guó)Abcam 公司, 貨 號(hào): ab38449、 ab8805、 ab93926、 ab75745、ab141405、ab109268)；山羊抗兔Akt、GSK-3β、mTOR、p-mTOR 單抗(二抗,英國(guó)Abcam 公司,貨號(hào):ab8933、ab32391、ab2732、ab84400)。 ECG-6511 型心電圖儀(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)；TK77-TKr-200C型小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；3550UV 酶標(biāo)儀、7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司)；電泳儀、CheniDocXRS 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及給藥方法

取50 只大鼠,按體重排序隨機(jī)分為5 組:假手術(shù)組、模型組、參附低、中、高劑量組,各10 只；假手術(shù)組:左冠狀動(dòng)脈前降支穿線、不接扎,穿線前10 min 股靜脈推注2 mL/100 g 注射用生理鹽水；模型組:缺血前10 min 股靜脈推注2 mL/100 g 注射用生理鹽水；參附低、中、高劑量組分別在缺血前10 min股靜脈推注1、2、4 mL/100 g 參附注射液。

1.3.2 心肌缺血再灌注模型制備

術(shù)前12 h 禁食不禁水,以1 g/kg 腹腔注射20%烏拉坦進(jìn)行麻醉,仰臥位固定大鼠,連接動(dòng)物呼吸機(jī),給予正壓通氣(呼吸頻率55～60 次/分、潮氣量2 mL/100 g)；針式電極固定于四肢,連接心電圖儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖,棄去心電圖異常者；于左胸第三、四肋間做縱向切口,暴露心臟,用6-0 縫合線從左心耳根(左冠狀動(dòng)脈前降支)穿過,將直徑2.0 mm 的硅膠管防止于縫合線下方,除假手術(shù)組外,其余各組均立即結(jié)扎,以心電圖出現(xiàn)ST 弓背向上型抬高、QRS 波變寬振幅加大,提示結(jié)扎成功。結(jié)扎30 min 后進(jìn)行持續(xù)再灌注90 min,全程心電檢測(cè),記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖(50 mm/s、增益1 mV=10 mm)及VT、VF 心律失常發(fā)生情況。 除模型組、參附低劑量組各有1 只大鼠死亡外,其余均造模成功。

1.3.3 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定

采用TUNEL 法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情況。灌注結(jié)束后立即取大鼠心臟組織,切取冠狀動(dòng)脈前降支全層,放置于10%中性甲醛中,經(jīng)過脫水、包埋后,用切片機(jī)切成厚度為4 μm 的切片,后經(jīng)脫蠟、水化,PBS 洗滌晾干,加入蛋白酶K 溶液孵育20 min,PBS 再次洗滌晾干,每張TUNEL 檢測(cè)液50 μL,37℃避光孵育60 min,PBS 洗滌3 次后,滴加抗熒光淬滅封片液50 μL,蓋上蓋玻片,于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況,每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野,以細(xì)胞染色為棕色或棕紅色判定為陽性細(xì)胞,凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 心肌組織中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取大鼠心臟冠狀動(dòng)脈前降支部分組織,液氮中研磨后,加入0.5 mL 細(xì)胞裂解液,冰上孵育30 min,4℃12000 r/min 離心10 min(離心半徑10 cm),收集上清液,BCA 法進(jìn)行蛋白定量,取40 μg 樣本進(jìn)行SDS-PAGE 分離,電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)1 min,加入封閉液搖床封閉2 h,TBST 洗滌10 min×3 次,加入稀釋一抗,Akt (1 ∶500)、p-Akt (1 ∶500)、GSK-3β (1 ∶1000)、p-GSK-3β (1 ∶500)、mTOR (1 ∶1000)、p-mTOR (1 ∶500),4℃孵育過夜,加入稀釋二抗(1 ∶10000),常溫孵育2 h,于暗室中曝光、顯影,用凝膠成像系統(tǒng)掃描并用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,兩兩樣本比較采用SNKq 檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 多組間計(jì)數(shù)資料采用整體卡方檢驗(yàn),兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)α′需校準(zhǔn),α′ = α/[k×(K-1)/2],其中k 為組數(shù),α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)心電圖ST 段變化比較

缺血前各組心電圖ST 段比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 各組心電圖ST 段比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與假手術(shù)組比較,模型組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST 段明顯抬高(P＜0.05)；與模型組比較,參附低、中、高劑量組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min心電圖ST 段明顯降低(P＜0.05)；與參附低、中劑量組比較,參附高劑量組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST 段明顯降低(P＜0.05)；參附低劑量組與中劑量組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST 段比較無明顯差異(P＞0.05)。 見表1。

2.2 心肌缺血再灌注后VT、VF 發(fā)生率比較

缺血30 min 及再灌注90 min 期間假手術(shù)組大鼠均無VT、VF 發(fā)生；模型組及參附低、中、高劑量組缺血30 min 及再灌注90 min 期間VT、VF 發(fā)生率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；缺血30 min 參附中、高劑量組VT、VF 發(fā)生率均低于模型組(P ＜0.01)；再灌注90 min 參附高劑量組VT、VF 發(fā)生率均低于模型組(P＜0.01)。 見表2。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

假手術(shù)組、模型組及參附低、中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(1.18±0.36)%、(58.34±6.20)%、 (47.21 ± 5.32)%、 (41.60 ± 5.13)%、(35.46±4.57)%,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=202.286,P＜0.001)；與假手術(shù)組比較,模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(t=29.195,P＜0.001)；與模型組比較,參附低、中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均降低(t=4.087、6.054、9.224,P＜0.001)；與參附低劑量組比較,參附中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均降低(t = 2.339、5.180,P =0.032、＜0.001)；與參附中劑量組比較,參附高劑量組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(t=2.826,P=0.011)。見圖1。

2.4 心肌組織中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、mTOR、p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

心肌組織中p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)；與假手術(shù)組比較,模型組p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P＜0.05)；與模型組比較,參附低、中、高劑量組p-Akt、p-GSK-3β 及pmTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P＜0.05)；與參附低劑量組比較,參附中、高劑量組p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P＜0.05),且參附高劑量組低于參附中劑量組(P＜0.05)。 心肌組織中Akt、GSK-3β、mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見圖2A、圖2B。

表1 心肌缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)心電圖ST 段變化比較Table 1 Comparison of changes in ST segment of myocardial ischemia reperfusion at different times

表2 心肌缺血再灌注后VT、VF 發(fā)生率比較(%)Table 2 Comparison of the incidence of VT and VF after myocardial ischemia and reperfusion

圖1 TUNEL 染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況Note.A, Sham operation group.B, Model group.C, Shenfu low dose group.D, Shenfu middle dose group.E, Shenfu high dose group.Figure 1 TUNEL staining to detect myocardial apoptosis

圖2 心肌組織中蛋白表達(dá)Note.A, Western blot electrophoresis.B, Quantitative analysis of protein in myocardial tissue.Compared with sham group, aP＜0.05.Compared with model group, bP＜0.05.Compared with Shenfu low dose group, cP＜0.05.Compared with Shenfu middle dose group, dP＜0.05.Figure 2 Protein expressions in myocardial tissue

3 討論

臨床中缺血性心臟病以血管再通術(shù)為主要治療手段,但治療過程中往往存在心肌缺血再灌注損傷,易引發(fā)心肌出現(xiàn)一系列病理性改變,表現(xiàn)為心肌收縮功能異常、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變、心肌無復(fù)流等現(xiàn)象[5-6]。 引起心肌缺血再灌注損傷機(jī)制十分復(fù)雜,可能與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、自由基生成、鈣離子超載及心肌細(xì)胞凋亡等多方面有關(guān)。 研究顯示,心肌缺血后,患者心電圖ST 段異常抬高程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[7],應(yīng)用心電圖演變過程評(píng)價(jià)心肌缺血再灌注損傷的變化有重要意義。 目前,中藥在治療心肌缺血再灌注損傷方面具有多靶點(diǎn)、多層次、整體論治等多種優(yōu)勢(shì),已成為臨床研究的熱點(diǎn)[8-9]。參附注射液方源“參附湯”名方,在缺血再灌注損傷的保護(hù)方面具有確切作用[10],通過心電圖演變過程評(píng)價(jià)參附注射液對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的改善作用有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,模型組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST段明顯抬高,說明心肌缺血再灌注大鼠造模成功。應(yīng)用不同劑量參附注射液干預(yù)后,大鼠缺血及再灌注不同時(shí)間點(diǎn)心電圖ST 段明顯降低,且存在劑量依賴性,缺血后30 min 參附中、高劑量組VT、VF 發(fā)生率均低于模型組,提示參附注射液可有效改善心肌缺血再灌注損傷心電圖變化,降低心律失常發(fā)生率。 進(jìn)一步進(jìn)行TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與心電圖ST 段趨勢(shì)一致,證實(shí)參附注射液可有效抑制心肌細(xì)胞凋亡。 參附注射液由紅參、黑附片提取液制備而成,紅參具有活血化瘀、益氣安神的功效,紅參中含有人參皂苷Rg、Rb,具有較強(qiáng)清除氧自由基[11]；附片具有擴(kuò)張血管尤其是對(duì)冠脈具有較強(qiáng)的擴(kuò)張作用[12]。 參附注射液中紅參與黑附片共同作用,在擴(kuò)張血管的同時(shí)清除氧自由基,發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。

此外,本研究中,模型組心肌組織中p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于假手術(shù)組；與模型組比較,參附低、中、高劑量組心肌組織中p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低,且呈劑量依賴性,提示參附注射液對(duì)心肌缺血再灌注損傷的改善作用可能與抑制Akt/GSK-3β 信號(hào)通路激活有關(guān)。 缺血再灌注損傷是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因,Akt/GSK-3β/mTOR 信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路[13-14]。 Akt 在缺血后再灌注早期則處于激活狀態(tài),其上游PI3K 受到胞外信號(hào)刺激后,介導(dǎo)Akt分子發(fā)生膜轉(zhuǎn)位,繼而磷酸化激活進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),繼而將信號(hào)傳遞至mTOR 啟動(dòng)靶點(diǎn)TOR 復(fù)合體1,激活后的mTOR 參與心肌細(xì)胞凋亡過程[15-16]。 本研究應(yīng)用的參附注射液含有紅參提取液,紅參屬于益氣活血養(yǎng)陰類中藥,已有研究證實(shí)此類中藥具有改善心肌缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)通路的作用。 由此可知,參附注射液對(duì)心肌缺血再灌注損傷的改善作用可能與抑制Akt/GSK-3β 信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述,參附注射液可有效改善心肌缺血再灌注損傷心電圖變化,降低心律失常發(fā)生率,抑制心肌細(xì)胞凋亡,可能與抑制Akt/GSK-3β 信號(hào)通路激活有關(guān),為參附注射液的臨床應(yīng)用提供理論支持,但關(guān)于參附注射液是否存在其他調(diào)控通路改善心肌缺血再灌注損傷有待進(jìn)一步研究。