人乳微生物組學

董彩霞，王 暉，蔭士安

(1.甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000；2.中國人口與發(fā)展研究中心，北京 100081；3.中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

母乳喂養(yǎng)對嬰兒健康、免疫功能啟動以及程序化均非常重要，不僅影響嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育，還是維持腸道功能和免疫穩(wěn)態(tài)的必要條件[1]。母乳喂養(yǎng)可顯著降低嬰兒患壞死性小腸結(jié)腸炎、腹瀉、過敏和哮喘、炎癥性腸病、糖尿病和肥胖等疾病的風險[2]。母乳中含有其自身的微生物菌群(母體微生物組)，可能對母體乳腺健康和嬰兒細菌腸道定植、病原體的防護、免疫系統(tǒng)的成熟和營養(yǎng)素消化等均具有重要意義[3]；而且嬰兒腸道微生物定植過程還會影響其物質(zhì)代謝，可能對以后健康的程序化產(chǎn)生持久影響。

1 基本概述

1.1 微生物組學

大多數(shù)微生物生活在一個復雜的稱為微生物群(microbiota)的菌落中，由細菌、古細菌和真菌組成，也包括病毒和噬菌體。微生物組學(micro bionomics)是在特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)中所有微生物及其遺傳信息的組合，探尋微生物與微生物、微生物與宿主以及微生物與環(huán)境之間相互關(guān)系。微生物組學也將是揭示微生物多樣性與人和生態(tài)穩(wěn)定性之間關(guān)系的新興學科。

1.2 人乳微生物組學

人乳中存在的細菌構(gòu)成了人乳微生物組。人乳微生物組學(human breast milk microbiome)系采用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)研究人乳中存在的微生物種類、數(shù)量和影響因素，以及通過母乳喂養(yǎng)對喂養(yǎng)兒免疫功能的啟動、腸道免疫功能發(fā)育和對營養(yǎng)與健康狀況的近期影響和遠期效應。母乳微生物組是影響喂養(yǎng)兒腸道功能的最重要環(huán)境因素之一，為其提供特定信號指導免疫系統(tǒng)發(fā)育，是嬰兒微生物組發(fā)育必不可少的重要條件[4]。

2020年Zimmermann等匯總了44項研究涵蓋2 655例婦女的3 105份母乳樣本，有幾項報告母乳的細菌多樣性高于嬰兒或其母親的糞便；每項研究中可檢測到每種細菌分類標準的最大數(shù)量為58個門、133個類別、263個目、596個科、590屬、1 300種細菌和3 563個可操作分類單元。母乳中可檢出真菌、古細菌、真核和病毒DNA，母乳中微生物群落是受多種因素影響的復雜微生物組[5]。

1.3 人乳中微生物的多樣性

母乳具有獨特的微生物生態(tài)系統(tǒng)，而且母乳菌群與任何黏膜或糞便樣中的菌群均不相關(guān)[6]。母乳中微生物多樣性的研究結(jié)果顯示，母乳中常見的菌群是葡萄球菌屬和鏈球菌屬，其次是特定的乳酸菌[7]。使用焦磷酸測序?qū)δ溉槲⑸锝M進行的首次研究證明，母乳細菌菌群很復雜[8]；人乳中不同菌種的數(shù)量和豐度個體間差異很大。每個個體的母乳樣品中存在九個共同核心的菌群，包括鏈球菌、葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、假單胞菌、棒狀桿菌、拉氏菌、丙酸桿菌、鞘氨醇單胞菌屬以及根瘤菌科[8]。研究結(jié)果的不同可歸因于不同的采樣方法、分析處理規(guī)程以及DNA提取方法、具有較高細菌覆蓋率特定引物的選擇和測序平臺等，提示將來需要建立標準化的方法[6，9]。最近一項健康母乳(n=10)的宏基因組(metagenome)和微生物組研究中，通過與患有乳腺炎的婦女比較，發(fā)現(xiàn)健康核心微生物組包括葡萄球菌、鏈球菌、類桿菌、費氏桿菌、瘤球菌、乳桿菌、丙酸桿菌屬菌種、真菌、原生動物相關(guān)和病毒相關(guān)的序列，而患乳腺炎乳母的乳汁菌群主要是金黃色葡萄球菌[10]。

1.4 人乳微生物組學研究目的

由于檢測設(shè)備和分析技術(shù)的制約，以往難以開展人乳微生物組學的研究。目前已具備深入開展這方面研究的條件：①采用技術(shù)：目前可以采用16S和宏基因組測序、高通量培養(yǎng)、基因芯片、熒光原位雜交等技術(shù)開展人乳微生物組學研究；②研究的內(nèi)容：采用宏轉(zhuǎn)錄組、宏蛋白組、宏代謝組、基因芯片、同位素標記、單細胞測序等手段研究人乳中存在微生物的來源、種類、數(shù)量以及影響因素；③技術(shù)路線：通過上述多組學與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)的挖掘以及移植試驗等手段解決關(guān)鍵問題。隨著上述分析技術(shù)日趨成熟，人乳微生物組學的特點以及對母嬰健康狀況的影響將逐漸被揭示。

2 母乳與嬰兒配方食品喂養(yǎng)對嬰兒腸道微生物組的影響

已有很多研究結(jié)果顯示，母乳喂養(yǎng)和嬰兒配方食品喂養(yǎng)嬰兒有不同的腸道菌群，而且活性也有明顯差異[2，11]。這可能影響嬰兒對非傳染性疾病的易感性，例如嬰兒期和/或成年期變態(tài)反應性疾病和/或肥胖等。純母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群中雙歧桿菌、葡萄球菌和鏈球菌的相對豐度較高，而嬰兒配方食品喂養(yǎng)嬰兒的擬桿菌、梭狀芽孢桿菌、腸桿菌、腸球菌和拉克斯藻的相對豐度較高[12]。

2.1 母乳喂養(yǎng)的優(yōu)勢

與嬰兒配方食品(奶粉)喂養(yǎng)的新生兒/嬰兒相比，母乳及母乳中存在的微生物是產(chǎn)后啟動新生兒腸道免疫功能和驅(qū)動新生兒腸道微生物定植的一個重要紐帶[13]，屬于雙歧桿菌和葡萄球菌屬的特定母體腸道微生物菌株經(jīng)過母乳被轉(zhuǎn)運給嬰兒[14-15]；經(jīng)母乳喂養(yǎng)還可將母體乳酸菌和雙歧桿菌等微生物轉(zhuǎn)運給喂養(yǎng)兒，形成一種天然的保護機制，改善嬰兒腸道微生物菌群發(fā)育，提高以后對外環(huán)境的適應能力，降低發(fā)生腹瀉和營養(yǎng)不良的風險。母乳喂養(yǎng)研究結(jié)果還顯示，在每對母嬰中都存在特定的菌株成為家庭成員之間的獨特聯(lián)系，可能還會從母體那里轉(zhuǎn)移異常的微生物菌群。

2.2 母乳喂養(yǎng)與嬰兒配方食品喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群構(gòu)成

母乳喂養(yǎng)和嬰兒配方食品喂養(yǎng)微生物組的比較結(jié)果顯示，母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便微生物的特點為多樣性低于嬰兒配方食品喂養(yǎng)的嬰兒，但是富含雙歧桿菌和乳酸菌，且健康狀況良好，發(fā)生營養(yǎng)不良的風險較低；而嬰兒配方食品喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群受其生存環(huán)境中微生態(tài)的影響，糞便微生物的特點呈明顯多樣性，雙歧桿菌較低，以類桿菌、梭菌和大腸桿菌為主，容易導致喂養(yǎng)兒發(fā)生腸道微生態(tài)環(huán)境失衡、菌群失調(diào)，患感染性和過敏性疾病的風險[16]以及死亡率均明顯增加[17]。

2.3 微生物代謝組學研究結(jié)果比較

Tannock等[18]比較了山羊奶基嬰兒配方食品、牛奶基嬰兒配方食品或母乳喂養(yǎng)澳大利亞嬰兒的糞便菌群組成。每組各30例嬰兒，在嬰兒2月齡時采取糞便樣品，使用16srRNA基因序列焦磷酸測序技術(shù)分析糞便中總菌群序列，觀察到母乳喂養(yǎng)嬰兒的糞便代表性菌群組成與嬰兒配方食品(牛乳或羊乳基)喂養(yǎng)的嬰兒顯著不同，結(jié)果見表1，提示母乳喂養(yǎng)嬰兒的糞便中雙歧桿菌的豐度超過總菌群的10%，這與雙歧桿菌科的最高總豐度有關(guān)。然而當雙歧桿菌科的豐度較低時，毛螺菌科的豐度較高。

Madan等[19]比較了剖宮產(chǎn)和嬰兒配方食品補充喂養(yǎng)6周齡嬰兒的腸道微生物組。選擇的102例嬰兒中，70例自然分娩、32例剖宮產(chǎn)；生后6周齡時70例母乳喂養(yǎng)，26例混合喂養(yǎng)(母乳喂養(yǎng)+嬰兒配方食品)，6例完全嬰兒配方食品喂養(yǎng)。同樣采用16srRNA基因序列焦磷酸測序技術(shù)，分析了不同分娩方式與喂養(yǎng)方式嬰兒糞便中10個最豐富細菌菌屬的相對豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6周齡嬰兒的腸道微生物組與分娩方式、喂養(yǎng)方式有關(guān)，且混合喂養(yǎng)嬰兒的腸道微生物組趨勢類似于完全嬰兒配方食品喂養(yǎng)的嬰兒，結(jié)果見表2。

目前已有多項研究結(jié)果證明，與完全純母乳喂養(yǎng)的嬰兒相比，嬰兒配方食品喂養(yǎng)或過早導入輔食，將會顯著增加喂養(yǎng)兒以后發(fā)生肥胖風險，而且也有研究結(jié)果證明完全純母乳喂養(yǎng)與嬰兒配方食品喂養(yǎng)嬰兒的腸道微生物組存在顯著差異[11，18]。然而，未來還需要設(shè)計更完善的臨床雙盲隨機對照試驗，以確定嬰兒腸道微生物組的差異對嬰兒健康狀況的近期與長期影響。

表1 來自13個最具代表性細菌家族16srRNA基因序列平均豐度

表2 不同分娩方式與喂養(yǎng)方式嬰兒糞便中識別的10個最豐富細菌屬的相對豐度(%)

3 影響母乳微生物組的潛在因素

乳母的微生態(tài)環(huán)境影響其母乳喂養(yǎng)兒的免疫發(fā)育，從而影響嬰兒生命初期和晚期的健康狀況以及對某些疾病的易感性。因此乳母微生物組被認為是影響兒童健康的母體轉(zhuǎn)移因素的重要決定因素[5]。特定的圍產(chǎn)期因素可能會影響出生結(jié)局，因為這些因素也會改變母乳喂養(yǎng)兒微生物組的發(fā)育。遺傳因素、分娩方式、哺乳階段、喂養(yǎng)方式、過量使用抗生素、膳食不均衡、衛(wèi)生潔癖(不必要的嚴格衛(wèi)生)以及持續(xù)的壓力/應激都會影響母體微生物組[5，20]。微生物菌群組成的變化和紊亂以及微生物多樣性或豐富度的降低已被認為是疾病發(fā)生的重要危險因素[21]。上述影響母體微生物組的因素均會不同程度影響母乳微生物菌群組成。

3.1 分娩方式與喂養(yǎng)方式

分娩方式(自然分娩與剖宮產(chǎn))影響人乳微生物菌群成分。正常分娩的產(chǎn)婦初乳及其以后的乳汁中顯示微生物菌群多樣性和較高比例的雙歧桿菌和乳酸桿菌屬，而多項研究結(jié)果顯示剖宮產(chǎn)的產(chǎn)婦乳汁中的情況則相反[22]，盡管也有的研究沒有觀察到這樣微生物組分的差別。

在Moossavi等[23]的研究中，觀察到母乳喂養(yǎng)方式(直接哺乳與用泵抽吸母乳后用奶瓶喂哺)的母乳細菌多樣性和組成略有不同，這可能反映了用泵抽吸增加了外暴露，而直接哺乳則可減少外暴露。

3.2 早產(chǎn)與低出生體重

母乳中微生物成分也受胎齡(胎兒發(fā)育成熟程度)的影響，即足月兒與早產(chǎn)兒的母乳中微生物組成存在顯著差異。在足月分娩的樣品中，初乳中腸球菌的數(shù)量較少，而歧桿菌屬的數(shù)量較多[24]。

3.3 哺乳階段

一天的不同時間、哺乳階段會不同程度影響母乳成分，而且個體間差異較大[25]。有學者報道，初乳樣品中微生物多樣性高于成熟母乳。哺乳期已被描述為影響母乳微生物的因素之一[6，8]。最初，主導微生物群是魏氏菌、白帶菌、葡萄球菌、鏈球菌和乳球菌[6]，之后的母乳中微生物群含有高水平的韋永氏菌、細小桿菌、細毛病、乳桿菌、鏈球菌屬，雙歧桿菌和腸球菌屬菌群的水平也有所增加。

3.4 抗生素的使用

同樣明顯的是，圍產(chǎn)期抗生素或其他藥物的使用也會影響母體的微生物菌群，包括影響乳酸桿菌、雙歧桿菌和葡萄球菌的存在量[26]，降低乳樣中雙歧桿菌、葡萄球菌以及真細菌屬的豐度等。

3.5 乳母的健康狀況

母乳微生物組成分的變化與乳母的生理狀態(tài)、膳食習慣和營養(yǎng)狀況有關(guān)[6]。母親肥胖，其乳汁中雙歧桿菌屬和細胞因子水平會發(fā)生變化[27]，葡萄球菌屬、瘦素和促炎性脂肪酸水平會相應升高[28]，微生物多樣性相應降低[6]。患乳糜瀉的乳母其乳汁中細胞因子、桿菌屬和雙歧桿菌屬的水平降低[29]。與HIV非陽性乳母的乳汁相比，來自非洲HIV陽性乳母的乳汁顯示有較高的微生物多樣性和較高的乳酸桿菌屬[30]。

3.6 生存地理環(huán)境

地理位置(環(huán)境中微生物組)也會不同程度影響母乳中微生物構(gòu)成，而且個體間差異較大[25]。例如，人乳微生物組分析結(jié)果顯示，一般情況下母乳中存在葡萄球菌和鏈球菌屬以及乳酸菌菌株[8，13]，但是它們的相對數(shù)量和其他細菌的存在可能取決于生存的地理位置[24，31]。類似地，所有調(diào)節(jié)母親皮膚、口腔、陰道和腸道微生物菌群的因素都可能潛在調(diào)節(jié)人乳微生物組。然而，這需要來自不同地區(qū)代表性母乳樣本的研究。

3.7 乳母的膳食與營養(yǎng)狀況

膳食習慣很可能調(diào)節(jié)腸道微生物組和影響母乳的營養(yǎng)成分，使母乳微生物組發(fā)生變化，但關(guān)于乳母膳食對乳汁微生物組影響的研究較少。曾報道，當?shù)厥称泛推渌l(fā)酵食品與母嬰腸道微生物及母乳中存在的細菌具有共同微生物特征[32]。近年來通過動物模型試驗已證明，長鏈多不飽和脂肪酸可調(diào)節(jié)生命早期腸道微生物組的成分[33]。乳母膳食影響母乳的微生物群落，尤其是懷孕期間的膳食影響腸道微生物群落的形成[34]。

4 調(diào)節(jié)人乳微生物組的潛在意義

已知人乳中存在的主要細菌是鏈球菌、葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、假單胞菌、棒狀桿菌、羅爾斯通菌和丙酸桿菌屬。膳食是可能改變腸道菌群的強有力工具。

4.1 防止微生物群組成失衡

在動物模型試驗中觀察到微生物群組成失衡與某些疾病的易感風險增加有關(guān)。例如，日本的一項以獼猴為動物模型的研究結(jié)果顯示，孕期高脂肪膳食影響其子代的微生物組成成分及活性、代謝與健康狀況[35]。因此，破譯母乳微生物菌群對喂養(yǎng)兒特定腸道細菌的貢獻并促進營養(yǎng)和生活方式的改善，將有可能會開辟與微生物組成變化有關(guān)疾病風險的新的研究方向。

4.2 影響嬰兒腸道益生菌定植

一項安慰劑對照研究表明在懷孕和母乳喂養(yǎng)期間攝入益生菌可調(diào)節(jié)母乳微生物組，進一步調(diào)節(jié)嬰兒腸道雙歧桿菌定植[36]。最近，已有學者提出圍產(chǎn)期補充益生菌影響母乳中微生物組成，包括雙歧桿菌和乳桿菌，同時影響其他生物活性化合物(如人乳寡糖和乳鐵蛋白)的含量[37]。

4.3 預防感染性疾病和過敏

已證明特定的益生菌菌株可有效預防和治療生命早期的感染性疾病[38]，并且可以降低高危人群中嬰兒濕疹的風險[39]。有研究還發(fā)現(xiàn)，使用益生菌補充劑可影響陰道分娩乳母的乳汁微生物組成，而在剖宮產(chǎn)分娩的乳母的乳汁樣品中沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異，提示益生菌特異性依賴于分娩方式的調(diào)節(jié)[40]。在生命早期1 500天內(nèi)使用特定益生菌研討會(2016)的報告中，專家同意健康的圍產(chǎn)期生活可降低生命后期感染和自身免疫性疾病的風險。

5 展望

新技術(shù)和檢測儀器的進步增加了我們對母乳微生物群組成的了解，人乳微生物組學的研究已經(jīng)引起人們普遍關(guān)注，也是今后重點研究方向。由于該學科尚處在早期階段，還有巨大發(fā)展空間。

5.1 母乳微生物組對喂養(yǎng)兒免疫功能的影響

隨著人乳微生物組學相關(guān)數(shù)據(jù)的積累和分析手段的進步，將會使我們有可能從非常復雜的人乳微生物菌群構(gòu)成及變異中，了解母乳喂養(yǎng)對喂養(yǎng)兒的近期直接影響，如新生兒免疫功能的啟動、腸道發(fā)育和抵抗感染性疾病的能力等。

5.2 母乳微生物組對喂養(yǎng)兒的遠期健康效應

微生物組成成分的改變已被視為生活方式疾病發(fā)生發(fā)展的強大風險因素。因此需要設(shè)計良好的追蹤研究，觀察母乳喂養(yǎng)及母乳微生物組對喂養(yǎng)兒可能產(chǎn)生的遠期健康效應(成年期營養(yǎng)相關(guān)慢性病發(fā)展軌跡和易感性)，以探索每種母乳細菌及其活力對喂養(yǎng)兒健康的影響。

5.3 母乳微生物的來源及影響因素

仍需要開展更多的研究確定母乳中微生物的起源，例如來自母親皮膚/衣服、吸吮期間嬰兒的口腔負壓以及母親腸道到乳腺的遷移等。為了增進對母乳微生物組的了解，仍需深入研究不同地理區(qū)域、遺傳背景、環(huán)境、營養(yǎng)與膳食的母乳微生物組，以充分了解微生物組在提升嬰兒健康方面的潛能。

5.4 改善母乳微生物組的新實踐

已有研究結(jié)果顯示，多個圍產(chǎn)期因素影響通過母乳從母親向嬰兒的微生物轉(zhuǎn)移。因此孕中晚期和/或泌乳期可能為設(shè)計新的膳食改善或營養(yǎng)干預母乳微生物組提供新的目標，為調(diào)節(jié)母乳微生物菌群提供營養(yǎng)干預工具，促進母乳喂養(yǎng)，同時還可能降低非傳染性疾病的風險?；谌槟干攀晨赡苷{(diào)節(jié)母乳中的生物活性化合物和微生物，因此需要研究乳母膳食中營養(yǎng)成分與母乳微生物組的相互作用、添加人工合成成分對母乳微生物組以及對嬰兒健康的影響。

5.5 方法學研究

盡管目前很多人乳微生物相關(guān)的研究采用分子生物學技術(shù)，然而該技術(shù)的應用也有局限性。例如，由于細胞壁組成、DNA提取方法和可能會導致高估或低估細菌計數(shù)的微生物16S基因拷貝數(shù)量，因此無法分析母乳微生物的生存能力以及可能高估或低估的總細菌數(shù)。影響母乳微生物群組成測定的其他潛在因素包括采樣方法、DNA提取方法、測序平臺、16S細菌基因區(qū)域研究、16S數(shù)據(jù)庫以及使用的生物信息學渠道，因此需要提出標準化的步驟和驗證方法。同時高通量方法的分析成本偏高，應研究開發(fā)新的檢測技術(shù)，提高分析的效率和準確性，降低分析成本，推動人乳微生物組學研究。