大腸桿菌疫苗對(duì)胎兔肺發(fā)育成熟的影響

翁增鳳，陳 麗，陳光明

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院兒科 原解放軍福州總醫(yī)院，福建 福州 350025)

新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)又稱新生兒肺透明膜病，是新生兒科急癥，主要是肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)缺乏及肺結(jié)構(gòu)發(fā)育不成熟所引起的[1-2]。前期，筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)注射大腸桿菌(Escherichia coli，E.coil)疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答后能夠促進(jìn)胎兔PS中主要構(gòu)成成分磷脂的蛋白表達(dá)和生成，可能對(duì)胎兔肺的發(fā)育成熟具有潛在的積極作用。本研究通過觀察大腸桿菌疫苗干預(yù)后胎兔肺結(jié)構(gòu)和功能改變情況，旨在評(píng)價(jià)大腸桿菌疫苗是否能夠促進(jìn)胎兔肺發(fā)育成熟。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)新西蘭大耳雌性白兔共20只，雄性白兔2只，體重(3.33±0.24)kg，購自上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0011。大腸桿菌疫苗(成都天邦生物制品有限公司)。本研究通過醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 建模與分組

新西蘭大耳雌性白兔發(fā)情后與雄兔自然交配，以交配后第1天定義為妊娠第1天。妊娠期間常規(guī)飲食。將妊娠兔隨機(jī)分為兩組，每組10只；大腸桿菌疫苗組于妊娠第10天、第17天和第24天，乙醚吸入麻醉后，用陰道擴(kuò)張器暴露子宮頸，將大腸桿菌疫苗溶液用1mL注射器注射到子宮頸肌肉內(nèi)，用藥劑量為0.1mL·kg-1·d-1[3-4]；生理鹽水組于妊娠第10天、第17天和第24天，乙醚吸入麻醉后，用陰道擴(kuò)張器暴露子宮頸，注射部位及劑量同大腸桿菌疫苗組。

1.3 標(biāo)本采集和觀察指標(biāo)

妊娠第27天用氯胺酮靜脈注射麻醉后剖宮產(chǎn)，取胎兔用于：①觀察胎兔自然存活時(shí)間；②測(cè)定胎兔肺壓力-容積(pressure-volume，P-V)曲線：胎兔氣管插管(用24G靜脈留置針去掉金屬針頭作為氣管導(dǎo)管)后連接帶有刻度的玻璃瓶及玻璃管，利用玻璃管內(nèi)液體高度產(chǎn)生壓力梯度變化，先按10cm、20cm、30cm、40cm高度逐漸上升，后隨40cm、30cm、20cm、10cm、0cm回降，每級(jí)穩(wěn)定15s，記錄相應(yīng)壓力下的胎兔肺容積；③胎兔肺組織光鏡、電鏡觀察，肺干濕重比測(cè)量：光鏡切片HE染色，觀察肺組織病理改變；電鏡切片3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察肺超微結(jié)構(gòu)改變；取左下肺尖1.0×1.0×1.0 cm大小肺組織進(jìn)行干濕重比測(cè)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組胎兔自然存活時(shí)間比較

大腸桿菌疫苗組胎兔存活時(shí)間明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.53，P<0.01)，見表1。

表1 兩組胎兔存活時(shí)間比較

2.2 兩組胎兔肺P-V曲線比較

大腸桿菌組胎兔肺P-V曲線位于生理鹽水組之上，當(dāng)壓力為30cmH2O、40cmH2O時(shí)大腸桿菌組肺容積顯著大于生理鹽水組(P<0.05)，見圖1。

注：“*”表示與生理鹽水組比較， P<0.05。

2.3 兩組胎肺干濕重比

兩組胎兔出生體質(zhì)量和肺干重比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.44、0.24，P>0.05)，大腸桿菌組胎兔肺濕重顯著小于生理鹽水組，胎兔肺干濕重比顯著大于生理鹽水組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.87、5.26，均P<0.01),見表2。

表2 兩組胎兔肺干濕重比的比較情況

2.4 兩組胎兔肺光鏡組織病理學(xué)變化

生理鹽水組光鏡下可見部分肺泡塌陷，肺泡間壁相互貼近；大腸桿菌疫苗組可見肺泡擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)完整,見圖2。

注：A.大腸桿菌疫苗組；B.生理鹽水組。

2.5 兩組胎兔肺電鏡病理超微結(jié)構(gòu)改變

生理鹽水組可見完整細(xì)胞核，板層體呈空泡化改變，線粒體腫脹，體積增大，細(xì)胞游離面僅有少許微絨毛，可見微絨毛脫落。大腸桿菌疫苗組可見完整細(xì)胞核，板層體較生理鹽水組多，線粒體完整，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，細(xì)胞游離面可見微絨毛,見圖3。

注：Nu:細(xì)胞核；LB：板層體；Mi:線粒體；Er:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Mv:微絨毛。A.大腸桿菌疫苗組；B.生理鹽水組。

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T(helper T，Th)細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起重要作用，其中Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)胎肺發(fā)育成熟產(chǎn)生不利影響；而接種細(xì)菌疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，可能對(duì)胎肺發(fā)育成熟產(chǎn)生積極作用[3-4]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前接種大腸桿菌疫苗可明顯上調(diào)胎兔肺泡SP中磷脂生成和蛋白表達(dá)，但是，關(guān)于大腸桿菌疫苗宮內(nèi)注射能夠促進(jìn)胎兔肺結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育成熟的直接證據(jù)仍然有限。

3.1 大腸桿菌疫苗對(duì)胎兔肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟的影響

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)孕兔宮內(nèi)注射大腸桿菌疫苗和生理鹽水進(jìn)行干預(yù)，以此分別模擬誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和安慰劑對(duì)照。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水組鏡下可見部分肺泡塌陷，肺泡間壁相互貼近；而大腸桿菌組肺泡擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)完整。電鏡觀察到生理鹽水組板層體呈空泡化改變，線粒體腫脹，體積增大，細(xì)胞游離面僅有少許微絨毛，可見微絨毛脫落；而大腸桿菌組均可見完整細(xì)胞核，板層體數(shù)量較生理鹽水組多，線粒體均完整，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，細(xì)胞游離面可見微絨毛。板層體是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ，AEC Ⅱ)內(nèi)一種呈球形、內(nèi)含同心圓或平行排列的板層結(jié)構(gòu)，主要由磷脂、蛋白質(zhì)和糖胺多糖構(gòu)成，不僅是PS的貯存部位，也是PS的分泌顆粒，并以出胞的方式分泌PS，隨著肺發(fā)育成熟，板層體數(shù)量逐漸增加，所以板層體數(shù)量側(cè)面反應(yīng)胎肺的成熟情況[5]。因此，本研究結(jié)果提示產(chǎn)前接種大腸桿菌疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答可促進(jìn)胎兔AEC Ⅱ發(fā)育、改善肺超微結(jié)構(gòu)，對(duì)促進(jìn)胎肺結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟具有一定作用。

3.2 大腸桿菌疫苗對(duì)胎兔肺功能發(fā)育成熟的影響

NRDS患兒由于PS不足、肺泡萎陷、肺順應(yīng)性下降、通氣換氣功能受損，導(dǎo)致肺毛細(xì)血管損傷和膜的通透性增加，大量血漿蛋白質(zhì)和血管內(nèi)水分漏入肺泡，出現(xiàn)肺水腫，嚴(yán)重者肺泡內(nèi)的滲出液可形成一層“嗜依紅透明膜”，引起急性低氧血癥性呼吸衰竭[6-7]。本研究通過測(cè)繪兩組胎兔肺P-V曲線，發(fā)現(xiàn)隨著對(duì)胎兔肺外加壓力的遞增，大腸桿菌組胎兔肺容積明顯大于生理鹽水組，胎兔肺干濕重比明顯大于生理鹽水組。肺P-V曲線是反映肺順應(yīng)性的較好指標(biāo)，與肺通氣和換氣功能具有顯著相關(guān)性，肺干濕重比則能夠反映肺水腫和肺損傷的程度，肺濕重越大表示肺組織含水量越大，在一定程度上反映了肺水腫和肺損傷的嚴(yán)重程度[8]。因此，本研究結(jié)果提示產(chǎn)前接種大腸桿菌疫苗可減輕肺泡萎陷，有利于肺泡保持?jǐn)U張狀態(tài)，從而能更好地保持功能殘氣量，有利于維護(hù)肺的氣體交換功能。

綜上所述，產(chǎn)前接種大腸桿菌疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答可促進(jìn)胎兔肺AEC Ⅱ發(fā)育、改善肺超微結(jié)構(gòu)、促進(jìn)胎兔肺發(fā)育，進(jìn)而防止肺泡萎陷，促進(jìn)肺泡擴(kuò)張，增加肺容積，改善通氣和換氣功能，減輕肺泡內(nèi)滲出，減輕肺水腫，最終延長(zhǎng)胎兔的存活時(shí)間。提示產(chǎn)前接種大腸桿菌可能有利于減輕或防止NRDS發(fā)生，這也為預(yù)防早產(chǎn)兒NRDS的發(fā)生提供了新的思路。但關(guān)于炎癥狀態(tài)下改善胎肺AEC Ⅱ超微結(jié)構(gòu)機(jī)制尚不明確，今后仍需大量研究去證實(shí)，為炎癥誘導(dǎo)肺發(fā)育的安全性提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。