基于16SrRNA基因高通量測序方法分析多花黃精內(nèi)生細菌群落結構及多樣性

蔡媛 劉浩 王勇慶 謝景 黃建華 勞嘉 賀煒 張水寒

〔摘要〕 目的 采用高通量測序技術分析多花黃精內(nèi)生細菌的多樣性及菌群結構。方法 通過蒽酮-硫酸法測定多糖含量，采用通用引物對細菌16S rRNA高可變區(qū)（V3-V4區(qū)）進行PCR擴增，運用Illumina Miseq PE250高通量測序技術對擴增子進行測序，并用QIIME等軟件對測序序列進行生物信息學分析。通過Spearman相關性分析菌群與多糖含量的相關性。結果 多花黃精內(nèi)生菌測序共獲得90 628條有效序列和5 287個OTU，稀釋曲線和Coverage指數(shù)反映測序結果比較全面地覆蓋了多花黃精內(nèi)生細菌群落。Alpha多樣性分析表明，其內(nèi)生細菌多樣性程度高。在門水平，其優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）。屬水平，核心菌群由鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）組成。PICRUSt基因預測表明，多花黃精內(nèi)生細菌以代謝功能為主，主要包括能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等。通過Spearman相關性分析，在屬水平共得到19個菌群與多糖含量相關，其中3個屬呈正相關，16個屬菌群呈負相關。結論 多花黃精內(nèi)生細菌的多樣性程度高，存在多種不同種類的細菌，且菌群與多糖含量相關。該研究解析了多花黃精內(nèi)生細菌的多樣性、豐度及主要菌屬，對深入研究多花黃精內(nèi)環(huán)境有一定指導意義。

〔關鍵詞〕 多花黃精;16S rRNA;內(nèi)生細菌;多樣性;群落結構

〔中圖分類號〕R284.1 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.013

〔Abstract〕 Objective To analyze the bacterial diversity and their community structure from Polygonatum cyrtonema using high-throughput sequencing technology. Methods The polysaccharide content was determined by anthrone-sulfuric acid method. PCR amplification of 16S rRNA high variable region （V3/V4 region） of bacteria was performed by using universal primers. The sequencing of amplicons was conducted by using Illumina Miseq PE250 high-throughput sequencing technology， and bioinformatics analysis of sequencing sequences was performed using software such as QIIME. The correlation between endophytic bacteria and polysaccharide was analyzed by spearman correlation. Results A total of 90 628 effective sequences and 5 287 OTUs were obtained from the sequencing of endophytic bacteria in Polygonatum cyrtonema， and the dilution curve and coverage index reflected that the sequencing results comprehensively covered the endophytic bacterial community of Polygonatum cyrtonema. Alpha diversity analysis showed that the endophytic bacteria were highly diverse. At the level of the phylum， the dominant bacteria were Proteobacteria， Actinobacteria， Gemmatimonadetes， Firmicutes， and Acidobacteria. At the genus level， the core flora consists of Sphingomonas， Gemmatimonas， and Streptomyces. The PICRUSt gene prediction indicated that endophytic bacteria of Polygonatum cyrtonema were mainly metabolized， including energy metabolism， carbohydrate metabolism， and amino acid metabolism. Through spearman correlation analysis， the polysaccharide content associated with endophytic bacteria were obtained 19 bacterias at genus level. Among them， three genera were positively correlated and 16 genera were negatively correlated. Conclusion The diversity of endophytic bacteria in Polygonatum cyrtonema is high. There are many different kinds of bacteria， and the flora is related to polysaccharide content. The study analyzed the diversity， abundance and main genus of endophytic bacteria of Polygonatum cyrtonema， which has certain guiding significance for deep study on the internal environment of Polygonatum cyrtonema to quality.

〔Keywords〕 Polygonatum cyrtonema; 16S rRNA; endophytic bacteria; diversity; community structure

多花黃精為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum Mill.）多年生草本植物，以其根莖入藥，在我國擁有悠久的藥用歷史，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效[1]。多花黃精主要活性成分為黃精多糖，還含有薯蕷皂苷元、黃酮、氨基酸等成分，具有增強免疫力、抗病毒、延緩衰老等作用，是一味具有廣闊開發(fā)前景的藥食同源類中藥材[2-3]。

植物內(nèi)生菌是指在其生活史的某一個階段或整個階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細胞間隙并且正常情況下不引起病害的微生物。內(nèi)生菌廣泛分布于低等植物和高等植物的各個組織中，經(jīng)長期協(xié)同進化，內(nèi)生菌可幫助宿主合成或獨自合成對宿主植物有利的活性成分[4]。研究者發(fā)現(xiàn)陳皮在陳化過程中，其表面微生物可以引起陳皮藥效物質(zhì)成分變化，證明微生物菌群參與了陳皮中藥材品質(zhì)的變化[5-6]。目前，關于多花黃精菌群結構的分析未見報道，故本文首次研究了多花黃精根莖內(nèi)生菌群的結構組成，為后續(xù)探討內(nèi)生菌對多花黃精品種的影響奠定基礎。

既往對植物內(nèi)生菌的分離鑒定和生物學特征分析都是基于純培養(yǎng)，但微生物種類繁多，因此采用純培養(yǎng)方式對植物內(nèi)生菌進行正確分類存在較大困難，通過傳統(tǒng)的、依賴于培養(yǎng)的分離方法鑒定的微生物只占植物內(nèi)生菌總數(shù)的0.1%～10%，難以明確整體微生物菌群群落結構。第二代高通量測序技術對微生物進行深度測序，精確檢測低至萬分之一的痕量微生物，突破了傳統(tǒng)方法基于純培養(yǎng)的限制，可客觀而真實反映微生物群落自身及其與宿主之間的相互作用關系[7-9]。高通量測序不僅能確定樣品中微生物群落組成，還能明確其相對含量，為植物樣本中的內(nèi)生菌微生物群落的多樣性分析提供一種可靠的有效的方法。目前，高通量測序技術在土壤根際微生物、植物內(nèi)生菌、腸道菌群等樣品中的微生物多樣性分析得到廣泛應用[10-12]。故本研究通過基于Illumina MiSeq平臺的第二代測序技術對多花黃精內(nèi)生細菌的種類進行多樣性組成譜測序，并對其內(nèi)生細菌多樣性及其群落結構進行差異分析，旨在明確多花黃精根莖中的優(yōu)勢及特有菌群，并初步分析菌群與多糖含量之間的相關性，為后期深入探究多花黃精的品質(zhì)及功能菌群的尋找研究提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 ?樣品

多花黃精采于湖南省新化縣野生林下（111°05'37.25″E， 27°40'59.05″N），經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院生藥室劉浩主任鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），采集后去除泥沙分成兩份，一份保存于-80 ℃冰箱，一份烘干用于多糖含量測定。

1.2 ?主要儀器和試劑

UV 2500紫外-可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）;NanoDrop One核酸蛋白測定儀（ND-2000）;DNA凝膠電泳儀（北京六一DYCP-31DN）;PCR擴增儀（德國Eppendorf AG 22331）;植物DNA提取試劑盒（Omega公司）;高效高保真酶（NEB公司）;核酸純化試劑盒（Axygen公司）。

2 方法

2.1 ?總DNA提取

取鮮多花黃精的根莖用流水沖洗30 min，去除表面泥沙后于超凈工作臺內(nèi)用75%乙醇中浸泡5 min，接著置于8%次氯酸鈉浸泡2 min，最后用0.1%的氯化汞浸漂4 min，用無菌磷酸鹽緩沖溶液清洗多次獲得表面無菌的多花黃精。將多花黃精切成兩半，從中間掏取多花黃精塊，然后切成小塊并用無菌磷酸鹽緩沖溶液反復沖洗，取沖洗液于10 000 r/min 離心10 min，倒掉上清液，合并沉淀用于DNA提取。參照DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的純度。

2.2 ?PCR擴增及測序

總DNA用Nanodrop進行精確定量。PCR反應體系所用的引物為細菌16S rRNA V3-V4區(qū)通用引物338F： 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R： 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR反應體系（50 μL）：gDNA（50 ng/μL）1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.25 μL，高保真酶（5 U/μL）0.25 μL， dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，10×buffer 5.0 μL，ddH2O 40.25 μL。PCR反應條件：98 ℃ 5 min;98 ℃30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用核酸純化試劑盒純化回收。采用Quan-iT PicoGreendsDNA Assay Kit檢測試劑盒對回收產(chǎn)物精確定量，將樣品DNA濃度調(diào)整為20 pmol/L上機測序。測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成，每個樣本3個重復。

2.3 ?多花黃精多糖含量測定

采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量，具體參考《中華人民共和國藥典》2015年版。

2.4 ?數(shù)據(jù)處理及分析

2.4.1 ?原始測序數(shù)據(jù)處理 ?采用滑動窗口方法對FASTQ格式雙端序列進行質(zhì)量篩查，要求窗口中堿基平均測序準確率≥99%。隨后利用FLASH軟件對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進行配對連接[13]，根據(jù)樣本所對應的Index信息，將連接后的序列與樣本完全匹配，得到每個樣本最終的有效數(shù)據(jù)。

2.4.2 ?物種注釋及多樣性分析 ?通過QIIME軟件調(diào)用UCLUST序列比對工具[14]，默認以97%的序列相似度進行歸并和操作分類單元（operational taxonomic units， OTU）劃分，選取相對豐度值最高的OTU代表序列與Unit數(shù)據(jù)庫進行比對和物種注釋，并統(tǒng)計樣品在各個分類水平門、綱、目、科、屬的豐度信息。使用QIIME軟件分析計算樣品的Alpha多樣性值，包括Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)。使用MEGAN軟件構建樣品聚類樹，PICRUSt基因預測內(nèi)生細菌的生物學功能，綜上數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析得到多花黃精內(nèi)生細菌群落結構組成。

2.4.3 ?多糖含量與菌群相關性分析 ?選取屬水平總豐度前30的物種與多糖含量數(shù)據(jù)，通過Spearman相關系數(shù)，分析菌群與多糖含量之間的相關性。

3 結果

3.1 ?測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及多樣性分析

多花黃精樣品經(jīng)Illumina MiSeq高通量測序分析，樣品測得的序列長度分布在152～531 bp之間，通過質(zhì)控優(yōu)化共得到序列94 524條，序列平均長度409 bp。從序列長度的分布來看，與16S rRNA V3-V4區(qū)序列長度大致吻合。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫比對分析，共有90 628條序列與數(shù)據(jù)庫中的序列相似，序列有效性為95.88%，說明測序合理，可用于進一步分析。

對得到的多花黃精樣品有效序列進行Shannon稀釋曲線和等級聚類曲線分析。從Shannon曲線和等級聚類曲線（圖1）可以看出，曲線已較平緩，說明測序趨于飽和，表明取樣合理，通過對細菌16S rRNA V3-V4區(qū)的PCR擴增序列基本上能真實反映多花黃精內(nèi)生細菌的群落組成。

Alpha多樣性是指對樣品中微生物群落物種多樣性的分析，包括側重于體現(xiàn)群落豐富度的ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)，以及兼顧群落均勻度的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。Alpha多樣性指數(shù)見表1。Alpha指數(shù)常用于對比性分析，一般而言，ACE或Chao指數(shù)值越大，說明群落的豐富度越高。Simpsonn或Shanno指數(shù)值越高，說明群落的多樣性越高，其值越低則說明物種的多樣性越低。

3.2 ?OTU聚類統(tǒng)計及物種注釋

多花黃精樣品共獲得94 524條過濾后得到的拼接序列，可分為5 287個OTU。使用數(shù)據(jù)庫對OTU序列進行相似性比對，發(fā)現(xiàn)多花黃精內(nèi)生菌分類學地位明確的細菌有20個門、48個綱、121個目、208個科、432個屬。根據(jù)樣品物種注釋結果，選取在門、綱、目、科、屬水平上最大豐度排名前10物種進行統(tǒng)計分析（如圖2所示），在門水平上，Proteobacteria 和Actinobacteria分別占到了38.7%和16.6%，在綱的水平上，Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Gemmatimonadetes三者合計占比49.02%，在目水平上Gemmatimonadales和Betaproteobacteriales占比22.3%，在科的水平上，Gemmatimonadaceae和Burkholderiaceae合計占比21.52%，在屬的水平上，排名前10的菌主要是Sphingomonas、Gemmatimonas、Streptomyces、Paucibacter、Thermoactinomyces、Massilia、Shigella、Bradyrhizobium、Cupriavidus、Acinetobacter。其中Sphingomonas是優(yōu)勢菌群，大約占7%。

3.3 ?樣品中內(nèi)生細菌物種類群組成分析

從樣品中篩選相對豐度值前20進行物種分類樹統(tǒng)計，樣品的物種分類樹見圖3。從圖3可以看出，多花黃精內(nèi)生細菌種類主要在Proteobacteria、Verrucomicrobia、Terrabacteria group、FCB group 4個門，其中Proteobacteria占比為18%;從綱分類水平來看，主要是Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Burkholderiales、Actinobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Chthoniobacterales，其中Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria為優(yōu)勢菌綱;從目水平來看，Rhizobiales為優(yōu)勢菌目，占比達到了38.6%。從科分類水平來看，其優(yōu)勢菌群主要為Enterobacteriaceae、Pantoea、Gemmatinonadales等，其中Gemmatinonadales為優(yōu)勢菌科，占比達到了42.88%。從屬水平來看，其優(yōu)勢菌群主要集中在Pseudomonas、Streptomycetaceae、Gemmatimonadaceae等，其中Gemmatimonadaceae為優(yōu)勢菌屬，占比達到了50.16%。而基于16S rRNA二代測序水平注釋到細菌種的序列很少，可以確定細菌種名的更少，大部分都無法定種。

3.4 ?物種系統(tǒng)進化關系分析

為深入分析多花黃精中內(nèi)生細菌的系統(tǒng)進化關系，選取屬水平所對應OTU相對豐度排名前10位的系統(tǒng)進化數(shù)據(jù)，結合每個OTU相對豐度及物種注釋置信度進行整合，構建屬水平OTU的系統(tǒng)進化關系（見圖4）。該系統(tǒng)進化關系圖分為兩個部分，最里層為OTU代表序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，不同顏色代表其對應的屬名;外層為OTU相對豐度值大小。從圖中可以看出Paucibacter、Escherichia-Shigella、Cupriavidus、Massilia在系統(tǒng)進化上較為接近，聚為一支，而且其外層柱高差異性不明顯，從屬水平來看，這些物種的豐度差別不大，在進化上基本趨于一致。

3.5 ?內(nèi)生細菌中的基因功能分類分析

通過對多花黃精內(nèi)生細菌進行功能分類分析，共獲得20類主要功能，具體如圖5所示，主要體現(xiàn)在膜運輸、代謝、細胞信號傳導等方面。其中代謝包括能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、萜類及黃酮類化合物代謝、聚糖生物合成代謝等。上述獲得的多花黃精內(nèi)生細菌相關功能信息，為研究多花黃精內(nèi)生細菌與其有效成分的生物合成提供了參考依據(jù)。

3.6 ?內(nèi)生細菌與多糖含量相關性分析

通過蒽酮-硫酸法測得3個新化多花黃精樣品多糖含量分別為5.3%、4.5%、8.2%，選取屬水平總豐度前30的物種，通過Spearman相關系數(shù)分析，P<0.05，共得到19個與多糖含量相關的菌群，具體如圖6所示，其中Actinobacteraia門中的Pseudomonas、Enterobacter、Brucella 3個屬的菌群與多糖含量為正相關，表示該類菌群菌群豐度值越高，多花黃精中多糖含量越高。其余16個菌群與多糖含量為負相關，表示該類菌群菌群豐度值越高，多花黃精中多糖含量越低。

4 討論

本研究首次利用高通量測序技術對多花黃精內(nèi)生細菌進行研究，通過對16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)測序分析，檢測多花黃精內(nèi)生細菌群落結構多樣性。樣品共獲得涵蓋20個門、48個綱、121個目、208個科、432個屬的細菌，表明多花黃精內(nèi)生環(huán)境中存在著豐富的微生物，這些微生物不僅數(shù)量眾多，且種類也很豐富。

在門水平上得到的優(yōu)勢菌群為變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門，其中變形桿菌門豐度最高。研究表明，變形菌和放線菌有助于藥用植物產(chǎn)量及有效物質(zhì)含量的提高[15-16]，在促植物生長，防治病害方面發(fā)揮著重要作用[17]。在屬水平上，含量最高的為未分類細菌，這說明多花黃精樣品中蘊含大量未知微生物種類，有關多花黃精內(nèi)生細菌在屬水平上的研究還不夠深入，需要采用其他分析手段進一步鑒定確認。此外，分類學地位明確的、豐度居前10的菌主要是Sphingomonas、Gemmatimonas、Streptomyces、Paucibacter、Thermoactinomyces、Massilia、Escherichia-Shigella、Bradyrhizobium、Cupriavidus、Acinetobacter，這些菌群功能主要體現(xiàn)在降解酚類物質(zhì)[18]、固氮解磷促生長[19-22]、土壤改良[23]、合成多種次級代謝產(chǎn)物和酶[24]、植物病變等方面[25-26]，后續(xù)可依據(jù)其優(yōu)勢菌群功能對多花黃精進行深入研究，為解決多花黃精病變及有效物質(zhì)分子形成機制提供技術支持。選取屬水平豐度前30的物種與多糖含量進行相關性分析，共獲得19個菌群與多糖含量呈顯著相關。Pseudomonas、Enterobacter、Brucella與多糖含量呈顯著性正相關，Sphingomonas、Gemmatimonas、Streptomyces、Paucibacter、Thermoactinomyces等16個菌群與多糖含量呈負相關。通過比對分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群占比最大的，大部分與多糖含量呈負相關性，可能與內(nèi)生細菌以多糖等碳水化合物為基礎代謝底物進行代謝消耗有關。

本研究結果初步探討了多花黃精內(nèi)生細菌菌群結構多樣性及其潛在功能特征，下一步的工作將重點從以下幾個方面展開：（1）分離多花黃精根莖內(nèi)生細菌菌株，評估其抗菌、抗蟲害、產(chǎn)生多糖或黃酮等活性成分能力，篩選獲得具有藥用和工業(yè)應用潛力的菌株。（2）對不同生長環(huán)境、產(chǎn)地多花黃精的品質(zhì)及其內(nèi)生細菌進行分析，闡述其“菌-質(zhì)”關聯(lián)性。

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