滅幽湯對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎脾胃濕熱證模型小鼠FoxO3a、Bim和FasL的影響

徐寅 張彧 陳末 周義方 曾蓉 郭璇 喻斌 王小娟

〔摘要〕 目的 觀察滅幽湯對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（Hp associated gastritis， HAG）脾胃濕熱證模型小鼠FoxO3a、Bim和FasL的影響，探討其對(duì)HAG脾胃濕熱證的治療機(jī)制。方法 將60只SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為模型組、胃四聯(lián)組、低劑量滅幽湯組（滅幽低組）、中劑量滅幽湯組（滅幽中組）、高劑量滅幽湯組（滅幽高組）、正常組，共6組，每組10只。除正常組外其余5組均采用復(fù)合病因（肥甘食物+幽門螺桿菌+濕熱環(huán)境）造模法建立HAG脾胃濕熱證小鼠模型，造模成功后，各組予以相應(yīng)干預(yù)，正常組及模型組予以蒸餾水灌胃，連續(xù)14 d。TUNEL法檢測(cè)胃黏膜細(xì)胞凋亡情況，Western blot、RT-PCR分別檢測(cè)胃黏膜組織FoxO3a、FasL和Bim蛋白表達(dá)及基因含量。結(jié)果 TUNEL法檢測(cè)胃黏膜細(xì)胞凋亡情況：模型組較正常組細(xì)胞凋亡情況明顯增多，除滅幽低組外其余治療組細(xì)胞凋亡情況較模型組明顯減少。與正常組比較，模型組FoxO3a、FasL、Bim蛋白及mRNA表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，滅幽高組、滅幽中組、胃四聯(lián)組FoxO3a、FasL、Bim蛋白及mRNA表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 中、高劑量滅幽湯能有效治療HAG脾胃濕熱證，其機(jī)制可能是滅幽湯通過調(diào)控FoxO3a表達(dá)，下調(diào)凋亡因子FasL和Bim含量來抑制胃上皮細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。

〔關(guān)鍵詞〕 幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎;滅幽湯;脾胃濕熱證;細(xì)胞凋亡;FoxO3a;FasL;Bim

〔中圖分類號(hào)〕R256.3 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.010

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Mieyou Decoction on FoxO3a， Bim and FasL in mice with helicobacter pylori （HP）-associated gastritis （HAG） of spleen-stomach damp-heat syndrome， and to explore its therapeutic mechanism on HAG of spleen-stomach damp-heat syndrome. Methods A total of 60 SPF-level BALB/c mice were randomly divided into a model group， a stomach quadruple group， a high-dose Mieyou Decoction group （Mieyou high group）， and a low-dose Mieyou Decoction group （Mieyou low group）， a middle-dose Mieyou Decoction group （Mieyou middle group）， and a normal group， a total of 6 groups， with 10 mice in each group. The mouse model of HAG of spleen-stomach damp-heat syndrome was established by the composite cause （fat food + helicobacter pylori + damp heat environment） for the other 5 groups except the normal group. After successful modeling， the mice were given the corresponding intervention. The normal group and the model group were given distilled water by gavage， for consecutive 14 days. The apoptosis of gastric mucosa was detected by TUNEL method. The expressions and gene content of FoxO3a， FasL and Bim proteins in gastric mucosa were detected by Western blot and RT-PCR. Results The apoptosis rate of gastric mucosa was detected by TUNEL method. The apoptotic cells in the model group were significantly increased compared with the normal group. The apoptotic cells in the other treatment groups were significantly reduced compared with the model group， except the Mieyou low group. The expression of FoxO3a， FasL and Bim protein and mRNA in the model group was significantly increased than that in the normal group （P<0.01）. Compared with the model group， the expression of FoxO3a， FasL and Bim protein and mRNA in the Mieyou high group， the Mieyou middle group and the stomach quadruple group were decreased when compared with the model group， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion The middle and high dose Mieyou Decoction can effectively treat HAG of spleen-stomach damp-heat syndrome. The mechanism may be that Mieyou Decoction can inhibit the apoptosis of gastric epithelial cells by regulating the expression of FoxO3a and down-regulating the content of apoptosis factors FasL and Bim.

〔Keywords〕 HP associated gastritis; Mieyou Decoction; spleen-stomach damp-heat syndrome; apoptosis; FoxO3a; FasL; Bim

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）是定植于胃黏膜黏液層的一種慢性致病菌，我國(guó)的感染率約為63.4%[1]，Hp產(chǎn)生的毒素及部分酶能破壞胃黏膜屏障，從而影響多種微量元素及營(yíng)養(yǎng)素的吸收，長(zhǎng)期感染Hp后，胃黏膜可進(jìn)一步萎縮和化生，發(fā)展為胃黏膜不典型增生（上皮內(nèi)瘤變），甚則轉(zhuǎn)化為胃癌。感染Hp后發(fā)生的胃黏膜炎性改變稱為幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（Hp associated gastritis， HAG），從Hp感染引起非萎縮性/萎縮性胃炎、腸腺化生/異型增生（上皮內(nèi)瘤變）至胃癌的發(fā)病多階段過程已被普遍認(rèn)可。本課題組發(fā)現(xiàn)HAG脾胃濕熱證與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)聯(lián)[2]，在細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用的Fox轉(zhuǎn)錄因子的O亞家族（forkhead transcription factorsofthe O class， FoxOs）可激活或抑制多種靶基因[3]，如介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Bim[4]和FasL基因[5]。本課題組前期研究已證實(shí)，滅幽湯可通過調(diào)控TLR/NF-κB 炎癥信號(hào)通路抑制HAG 脾胃濕熱證模型小鼠胃黏膜炎癥反應(yīng)[6-8]，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究FoxO3a、Bim、FasL的變化，進(jìn)一步探討滅幽湯治療HAG脾胃濕熱證的作用機(jī)制，以期為臨床治療HAG脾胃濕熱證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 ?動(dòng)物與飼料

60只SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（17±1） g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：43004700043028。普通飼料購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。高脂飼料由普通飼料按等比例加入蜂蜜和豬油制得。

1.2 ?Hp菌株

幽門螺桿菌：悉尼標(biāo)準(zhǔn)菌株（Sydney strain I， SSI），其中含有CagA+和VacA+，濃度為1×109 CFU/mL，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原免疫學(xué)教研室提供。

1.3 ?試藥

滅幽湯：黃芩15 g，蒲公英20 g，三七6 g，白及10 g，青皮10 g，陳皮10 g，烏賊骨15 g，飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房。以上藥物用500 mL蒸餾水泡30 min后，武火熬至沸騰后改文火，繼續(xù)熬20 min，取汁另置，煎煮3次，合并煎液調(diào)整濃度至0.62 g/mL、1.24 g/mL和2.48 g/mL為滅幽湯低、中、高劑量。

胃四聯(lián)：麗珠維三聯(lián)（枸櫞酸鉍鉀片110 mg/片;克拉霉素片0.25 g/片;替硝唑片0.5 g/片，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，貨號(hào)：170701）;泮托拉唑腸溶膠囊40 mg/粒，杭州中美華東制藥有限公司，貨號(hào)：170950B。

1.4 ?主要實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗FoxO3a抗體（貨號(hào)10849-1-AP）購(gòu)自Prote？鄄intech Group公司;兔抗Fasl抗體（貨號(hào)ab15285）、Bim抗體（貨號(hào)ab7888）購(gòu)自abcam公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marke購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司;EDTA、Tris、DEPC、APS、SDS、Tween-20、TEMED購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;UltraSYBR Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司;引物購(gòu)自上海生工公司;快速尿素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海國(guó)藥生物公司;TUNEL試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司。在NCB上搜索目的基因的序列，F(xiàn)OXO3a的引物序列是F：CCGCCAGCCAGTCTATGCAA，R：AACCCGTCAGCATCCATGAGT，引物長(zhǎng)度190 bp。FasL引物序列為F：CTAATGTTTTCTGAGCCGACC，R：ACAGACATCATTGCACTGG，引物長(zhǎng)度109 bp。Bim引物序列為F：TCCCTACAGACAGAACCGCAAG，R：ATCAGTTGTACCAGGCATCACC，引物長(zhǎng)度175 bp。

1.5 ?主要儀器

TS-92水浴搖床（江蘇其林貝爾公司）;PIKO REAL 96熒光定量RCP儀、SPL0960熒光PCR板（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;164-5050電泳儀（美國(guó)Bio-rad公司）;BA210T顯微鏡（廈門Motic公司）;YD-315切片機(jī)（浙江益迪試驗(yàn)器材）;TGL-18R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）。

2 方法

2.1 ?造模

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組10只與造模組50只。造模組按參考文獻(xiàn)[9]復(fù)合病因（肥甘食物+濕熱環(huán)境+Hp菌液）方法建立HAG脾胃濕熱證小鼠模型。從分組后第1天開始，造模組給予高脂飼料自由飲食，第13天開始放入濕熱箱中，溫度：（32±2） ℃，相對(duì)濕度：95%，每天放入6 h，第18天開始感染Hp菌液（每只1×109 CFU/mL濃度，0.2 mL/d），隔日感染1次，共5次，感染后定植2周，感染及定植Hp期間繼續(xù)給予高脂飼料及濕熱箱飼養(yǎng)。Hp感染方法如下：在用Hp菌液灌胃前，所有BALB/c小鼠先禁食24 h，模型組小鼠灌注1×109 CFU/mL濃度的Hp菌液0.2 mL/只，灌胃后4 h給予食物和水。期間正常組同步給予普通飲食，灌胃等體積生理鹽水，注意正常組與造模組食水分開。第37天正常組及造模組隨機(jī)選取小鼠各2只、8只，處死后取胃組織采用快速尿素酶試驗(yàn)及HE染色檢測(cè)模型。

造模過程中，觀察動(dòng)物癥狀（精神狀態(tài)、飲食情況，大便性狀）、飲水、食量、體質(zhì)量、肛溫、毛色及毛的順滑等情況。

模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：小鼠精神不振，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)無光澤，喜聚集而少動(dòng)，體質(zhì)量減輕，肛溫升高，小便黃，大便稀軟;快速尿素酶試驗(yàn)檢測(cè)胃竇黏膜Hp種植情況，結(jié)果陽性提示造模成功。HE染色觀察胃黏膜組織病理學(xué)改變及炎癥程度。

2.2 ?分組及干預(yù)

造模成功后，造模組按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組8只。即模型組、高劑量滅幽湯組（滅幽高組）、中劑量滅幽湯組（滅幽中組）、低劑量滅幽湯組（滅幽低組）、胃四聯(lián)組。第38天開始灌胃給藥。給藥劑量參考成人平均體質(zhì)量60 kg，根據(jù)臨床用藥劑量與動(dòng)物用量的比例換算動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的中藥劑量，滅幽湯干預(yù)低、中、高劑量分別為6.2、12.4、24.8 g/kg），每日灌胃1次。胃四聯(lián)組予以麗珠維三聯(lián)（成人每日劑量為枸櫞酸鉍鉀片0.3 g/片×4片+替硝唑片0.5 g/片×2片+克拉霉素片0.25 g/片×2片）+泮托拉唑鈉腸溶膠囊（成人每日劑量為80 mg）。將各藥物研碎混合溶于蒸餾水中，給藥劑量為280.6 mg/kg，每只給予藥液量0.1 mL/10 g，每日灌胃1次。正常組和模型組小鼠予以等容量蒸餾水。干預(yù)14 d。

2.3 ?取材

脫頸處死小鼠，剖腹取全胃，沿胃大彎剪開，4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈后摘取胃竇、胃體的組織置于4%多聚甲醛保存，行HE染色;另將剩余胃組織一分為二，一分行Western blot，另一分行RT-PCR，保存于-20 ℃冰箱中。

2.4 ?指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 ?小鼠的癥狀及一般生理情況 ?觀察造模、給藥后小鼠毛色、活動(dòng)度、飲食、飲水、體質(zhì)量、肛溫的變化情況。

2.4.2 ?快速尿素酶試驗(yàn)檢測(cè)Hp感染 ?將新鮮小鼠胃黏膜組織放入快速尿素酶檢測(cè)反應(yīng)孔，15～30 min內(nèi)觀察反應(yīng)孔顏色變化，試劑由黃變紅為陽性，提示小鼠胃黏膜組織存在Hp感染。

2.4.3 ?小鼠胃黏膜組織病理學(xué)觀察 ?將小鼠胃竇、胃體組織行HE染色后光鏡下觀察。60 ℃烤片12 h;切片脫蠟：將切片置于二甲苯中1 h。然后依次在100%、95%、85%、75%乙醇，每次放置5 min。浸洗后改用蘇木素染色，沖洗，PBS處理;伊紅染1 min，沖洗;梯度酒精脫水，直接把片子烤干。置于二甲苯中20 min，最后封片，光鏡下觀察。

2.4.4 ?TUNEL法檢測(cè)胃黏膜細(xì)胞凋亡情況 ?切片常規(guī)脫蠟，60 ℃烤1 h后置于二甲苯中脫蠟2次，乙醇水合后在封閉前后漂洗;放入緩沖液中進(jìn)行加熱至沸騰，再冷卻至室溫。冷卻后PBS洗滌，生物素封閉A液孵育20 min。切片浸入PBS漂洗，再加入封閉B液孵育20 min。切片浸入PBS漂洗，進(jìn)行熒光標(biāo)記：配制TdT酶反應(yīng)液加入樣本中放入溫盒，將配制好的Streptavidin-HRP標(biāo)記液加入再次漂洗結(jié)束的樣本后，再次反應(yīng)漂洗后進(jìn)行顯色及復(fù)染，染色后分化5 s，沖洗干凈。無水乙醇及二甲苯浸洗后晾干封片，光鏡觀察，細(xì)胞核染成棕（黃）色或褐色染色為陽性細(xì)胞。

2.4.5 ?Western blot檢測(cè)FoxO3a、FasL和Bim的蛋白表達(dá) ?分別提取各組小鼠肺組織總蛋白。將10%～12%分離膠加入TEMED，晃均封膠。凝膠后倒去異丙醇，吸干后進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜。完成后，用1×TBST沖洗膜5 min，再用麗春紅染色，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜率。再將膜浸入用脫脂奶粉中室溫封存1.5 h再分別與FoxO3a、FasL和Bim的一抗（兔抗）結(jié)合。結(jié)束后洗膜再與二抗結(jié)合90 min，漂洗。ECL法檢測(cè)NC膜進(jìn)行圖像分析，用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量各蛋白條帶的灰度值，以與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的百分比表示結(jié)果。

2.4.6 ?RT-PCR法檢測(cè)FoxO3a、FasL和Bim基因相對(duì)表達(dá)量 ?提取小鼠胃組織的RNA，在定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本每個(gè)指標(biāo)3個(gè)孔，共30 ？滋L體系，每孔10 ？滋L。定量PCR擴(kuò)增程序：依次95 ℃10 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)。采用參照基因2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)水平的相對(duì)量，各基因的表達(dá)水平使用相對(duì)定量法計(jì)算。

2.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，首先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布、方差齊性，采用單因素方差分析，同時(shí)用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，則用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?小鼠一般狀態(tài)觀察

正常組小鼠食欲、飲水正常，精神狀態(tài)良好，皮毛光澤順滑，二便正常，肛溫保持恒定，體質(zhì)量漸增;造模組小鼠在模型建立過程中逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)，食欲下降，飲水減少，皮毛松弛無光澤，小便黃，大便稀軟等表現(xiàn)。依據(jù)《脾胃濕熱證中醫(yī)診療專家共識(shí)意見（2017）》[7]中脾胃濕熱證的辨證依據(jù)，出現(xiàn)食少納呆、少飲、大便溏、肢體困重等均為脾胃濕熱證的表現(xiàn)。造模結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，造模組小鼠均符合脾胃濕熱證的上述行為學(xué)變化。

3.2 ?Hp種植情況

快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示：正常組為陰性，造模組小鼠試劑由黃色變?yōu)榧t色，試驗(yàn)結(jié)果都為陽性，提示Hp感染成功。

HE染色結(jié)果顯示：正常組小鼠胃黏膜組織光滑，腺體排列較整齊，無明顯充血腫脹。造模組小鼠胃黏膜組織可見嗜酸性、中性粒、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體雜亂，充血，且固有層內(nèi)亦可見淋巴濾泡、嗜酸性粒、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，符合慢性非萎縮性胃炎的表現(xiàn)。見圖1。

根據(jù)模型小鼠一般狀態(tài)觀察、快速尿素酶試驗(yàn)及HE染色結(jié)果，可判定HAG脾胃濕熱證小鼠模型建立成功。

3.3 ?TUNEL法檢測(cè)各組小鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡的情況

光鏡下細(xì)胞核染成棕（黃）色或褐色為TUNEL陽性染色。由圖2可知，正常組處于凋亡期的細(xì)胞較少，細(xì)胞凋亡情況最低;模型組細(xì)胞凋亡情況最嚴(yán)重;滅幽低組凋亡情況較模型組無明顯變化;滅幽中組、滅幽高組、胃四聯(lián)組細(xì)胞凋亡情況高于正常組，低于模型組。見圖2。

3.4 ?各組小鼠胃黏膜組織FoxO3a、FasL和Bim蛋白表達(dá)的變化比較

模型組FoxO3a、FasL和Bim蛋白表達(dá)升高，與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，滅幽高組、滅幽中組、胃四聯(lián)組FoxO3a、FasL和Bim蛋白表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），滅幽低組FoxO3a、FasL和Bim蛋白表達(dá)與模型組比較有下降趨勢(shì)，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與胃四聯(lián)組比較，滅幽高組、滅幽中組FoxO3a、FasL和Bim蛋白表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;滅幽高組FoxO3a、FasL和Bim蛋白表達(dá)降低，與滅幽中組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與滅幽低組比較差異有顯著性差異（P<0.01）。見圖3-4。

3.5 ?各組小鼠胃黏膜組織FoxO3a、FasL和Bim mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

模型組FoxO3a、FasL和Bim mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，滅幽高組、滅幽中組、胃四聯(lián)組FoxO3a、FasL和Bim mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而滅幽低組FoxO3a、FasL和Bim mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較有下降趨勢(shì)，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與胃四聯(lián)組比較，滅幽高組、滅幽中組FoxO3a、FasL和Bim mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與滅幽低組比較，滅幽高組FoxO3a、FasL和Bim mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

4 討論

Hp感染直接觸發(fā)細(xì)胞凋亡并通過炎癥損傷誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是HAG胃黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制。FoxOs在機(jī)體不同狀態(tài)的細(xì)胞凋亡過程中都發(fā)揮了調(diào)控作用。FoxOs既可能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，又可能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這種看似矛盾的調(diào)控作用與機(jī)體功能狀態(tài)、細(xì)胞種類和FoxOs的激活方式等都密切相關(guān)。Bim能與抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL及Mcl-2等共同作用從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。FoxO3a調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通過直接誘導(dǎo)前凋亡基因Bim的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄[10-11]。有學(xué)者研究BaF3/BcrR-ABL細(xì)胞系及乳腺癌細(xì)胞MCF-7，發(fā)現(xiàn)FoxO3a可在轉(zhuǎn)錄水平上直接對(duì)Bim的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，且證實(shí)了在Bim啟動(dòng)子上有FoxO3a、Mab及RUNX3的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[12]。在胃癌的研究中，科學(xué)家已經(jīng)證實(shí)FoxO3a與RUNX3共同激活Bim基因，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡[13]。FoxOs亦可以提高FasL和TRAIL基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控細(xì)胞凋亡[14]。沉默F(xiàn)oxO3a可抑制gAcrp介導(dǎo)的Caspase-3/7及FasL的表達(dá)使細(xì)胞凋亡減少[15]。當(dāng)FasL在胃炎組織淋巴細(xì)胞表面表達(dá)[16]，F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白會(huì)使胞質(zhì)中Caspase-8募集Fas，使其受體活化，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[17]。研究表明[18]，Hp誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與Fas受體相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)IL-8可以通過上調(diào)Fas的表達(dá)來提高細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MFoxO3a、FasL、Bim的蛋白表達(dá)及基因含量明顯高于正常組，說明Hp可能誘導(dǎo)FoxO3a表達(dá)上調(diào)FasL、Bim的含量，從而誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡。

《濕熱病篇》有“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，邪正相爭(zhēng)，故病濕熱”“濕熱病屬陽明太陰經(jīng)者居多”等論述，結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)證候研究發(fā)現(xiàn)[19]，在Hp感染患者證型中脾胃濕熱證居多，所以本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為Hp可歸屬濕熱之邪。清熱祛濕法為治療HAG之大法，加之“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚”，也只有行氣和胃才能暢達(dá)其氣機(jī)，恢復(fù)脾升胃降的生理功能，故HAG治法當(dāng)首選清熱祛濕、行氣和胃為本。滅幽湯中黃芩清上、中二焦之濕熱為君藥，陳皮、蒲公英共奏清熱健脾祛濕之效為臣藥，青皮、三七、白及、烏賊骨共為佐藥，發(fā)揮行氣活血、制酸止痛之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：滅幽中組、滅幽高組及胃四聯(lián)組小鼠在給藥治療后，較模型組小鼠FoxO3a、FasL和Bim降低，趨向正常組，提示滅幽中、高組能通過FoxO3a調(diào)控凋亡因子FasL和Bim來抑制細(xì)胞凋亡，從而有效治療HAG脾胃濕熱證;滅幽低組與模型組比較，指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，滅幽中、高組組間比較無明顯差異;滅幽湯低、中、高劑量采用動(dòng)物等效量的0.5、1、2倍量，說明滅幽湯發(fā)揮治療作用的前提是在一定濃度下，但亦不是濃度越高效果越好，與臨床等效劑量即中劑量為最優(yōu)選擇。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉文忠.“幽門螺桿菌胃炎京都全球共識(shí)”解讀[J].胃腸病學(xué)，2015，20（8）：449-456.

[2] 王小娟，郭建生，李 ?倩，等.滅幽湯對(duì)濕熱型胃炎伴幽門螺桿菌感染胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2007，15（4）：258-259.

[3] CHERDANTSEVA L A， POTAPOVA O V， SHARKOVA T V， et al. Association of Helicobacter pylori and iNOS production by macrophages and lymphocytes in the gastric mucosa in chronic gastritis[J]. Journal Immunology Research， 2014， 76（2）： 5-14.

[4] WANG J， LIU S， YIN Y， et al. FoxO3-mediated up-regulation of Bim contributes to rhein-induced cancer cell apoptosis[J]. Apoptosis， 2015， 20（3）： 399-409

[5] MARFE G， TAFANI M， FIORITO F， et al. Involvement of FOXO transcription factors， TRAIL-FasL/Fas， and sirtuin proteins family in canine coronavirus type II-induced apoptosis[J]. PLoS ONE， 2011， 6（11）： e27313.

[6] 王小娟，尹 ?姣，郭建生，等.滅幽湯對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎小鼠胃黏膜組織TLR2、NF-κBp65的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（7）：18-22，65.

[7] 施花錦，王小娟，伍參榮，等.滅幽湯對(duì)幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠胃組織IKKβ表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（1）：33-35.

[8] 王小娟，施花錦，郭建生，等.滅幽湯對(duì)小鼠幽門螺桿菌感染性胃炎NF-κB表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（3）：12-13，47.

[9] 陳 ?末，喻 ?斌，徐 ?寅，等.滅幽湯對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎脾胃濕熱證模型小鼠NLRP3、caspase-1和mTOR蛋白的影響[J].河南中醫(yī)，2019，39（3）：354-358.

[10] LUO H， YANG Y， DUAN J， et al. PTEN-regulated AKT/FoxO3a/Bim signaling contributes to reactive oxygen species-mediated apoptosis in selenite-treated colorectal cancer cells[J]. Cell Death & Discase， 2013， 4（2）： e481.

[11] LIUY， ZHANGW F， WUX L， et al. Foxo3a-dependent Bim transcription protects mice from a high fat diet via inhibition of activation of the NLRP3 inflammasome by facilitating autophagy flux in kupffer cells[J]. Oncotarget， 2017， 23， 8（21）： 34258-34267.

[12] ZHOU Z Q， WANG T， PAN L M， et al. FoxO4 is the main forkhead transcriptional factor localized in the gastrointestinal tracts of pigs[J]. Journal of Zhejiang University-Science B， 2007， 8（1）：39-44.

[13] YAMAMURA Y， LEE W L， INOUE K， et al. RUNX3 cooperates with FoxO3a to induce apoptosis in gastric cancer cells[J].The Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（8）： 5267-5276.

[14] CHEN Q H， GANAPATHY S， SINGH K P， et al. Resveratrol induces growth arrest and apoptosis through activation of FOXO transcription factors in prostate cancer cells[J]. PLoS One， 2010， 5（12）： e15288.

[15] SHRESTHA A， NEPAL S， KIM M J， et al. Critical role of AMPK/FoxO3A axis in globular adiponectin-Induced cell cycle arrest and apoptosis in cancer cells[J]. Journal of Cellular Physiology， 2016， 231（2）： 357-369.

[16] GRYKO M， GUZINSKA K， PRYCZNICZ A， et al. Correlation between fas and fasL proteins expression in normal gastric mucosa and gastric cancer[J]. Folia Histochem et Cytobiol， 2011， 49（1）： 142-147.

[17] GOMES T S， OSHIMA C T， SEGRETO H R， et al. The extrinsic apoptotic signaling pathway in gastric adenocarcinomas assessed by tissue microarray[J]. Pathology Research and Practice， 2011， 207（10）： 613-617.

[18] 郭 ?濤，錢家鳴，張建中，等.幽門螺桿菌及其相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)胃上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控及相關(guān)機(jī)制[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（38）：2670-2673.

[19] 劉樂鑫，王靜濱，馬鵬莉，等.慢性非萎縮性胃炎中醫(yī)證型與幽門螺桿菌感染、胃鏡像及病理表現(xiàn)相關(guān)性分析[J].河北中醫(yī)，2019，41（10）：1505-1507，1511.