黃 星 歐銳金 李國興
廣東省羅定市人民醫(yī)院骨科(羅定 527200)
骨質(zhì)疏松是臨床常見的骨科疾病,在臨床主要表現(xiàn)為骨量以及骨密度的顯著性下降,在骨質(zhì)疏松患者的疾病進展過程中,骨折是較為常見的并發(fā)癥之一[1],嚴重威脅患者的生命質(zhì)量。生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[2],在對骨質(zhì)疏松患者的疾病進展中,破骨細胞發(fā)揮主導(dǎo)作用。而在骨折患者的重建過程中,由于病灶部位的骨折的重建速度過快,造成患者骨痂力度形成的強度不足[3]。在臨床對患者的治療過程中,富血小板血漿通過對多種炎性因子的釋放作用,促進患者的細胞增殖、分化以及血管的形成,對于患者的預(yù)后具有積極的意義[4]。強骨膠囊的主要成分為骨碎補,通過對患者的骨量的增加,對于患者骨痂的愈合具有積極的意義[5]。本研究通過對富血小板血漿聯(lián)合強骨膠囊對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折骨愈合的影響分析,為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。
80只未交配、3月齡雌性健康SD大鼠,所有大鼠平均體質(zhì)量為(202.45±2.12)g,室溫控制在(21±2)℃,濕度30%~70%,光照每晝夜12 h。將以上大鼠分為空白組(K組)、 PRP組(P組)、強骨膠囊組(Q組),聯(lián)合組(L組),每組大鼠20例,實驗全程嚴格按照國家有關(guān)實驗動物的規(guī)定執(zhí)行,經(jīng)醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員中心批準。
對所有的實驗大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后,皮膚消毒,暴露兩側(cè)卵巢及輸卵管,結(jié)扎輸卵管后切除雙側(cè)輸卵管,縫合傷口,連續(xù)3日每日肌注青霉素。3月后骨質(zhì)疏松模型建立。
大鼠自體富血小板血漿制備,與骨質(zhì)疏松性骨折模型前一天,眼眶采血采集P組及L組靜脈血2 mL,將血液介入含有枸櫞酸鈉溶液的離心管中,顛倒使其充分混勻,將大鼠做好標記。采用二次離心法中的landsbergs法,制備PRP;①先予3 659轉(zhuǎn)/min的速率離心10 min,取血漿層及兩層交界面下2 mm的液體放置于另外一新的離心管中,②以3000轉(zhuǎn)/min的速率離心10 min,液體分為兩側(cè),取剩下的1/4層即為PRP,將制備好PRP加入凝血酶激活劑,搖勻,PRP凝膠狀后置入- 20 ℃冰箱備用。
建立骨質(zhì)疏松性骨折內(nèi)固定大鼠模型。腹腔注射戊巴比妥麻醉后,取左后肢剃毛皮膚消毒,無菌條件下于脛骨前面上1/3中心作長約1.5 cm縱行切口,鈍性分離組織,鋸斷脛骨,骨折端復(fù)位后予醫(yī)用無菌1.0克氏針穿髓腔固定骨折端,并將克氏針尾端作折彎處理;同時P組及L組大鼠骨折端保持無菌環(huán)境注入制備好的PRP;縫合皮下組織及皮膚,術(shù)后每次大鼠每日肌注青霉素10萬U兩側(cè),連續(xù)3天。
聯(lián)合用藥組大鼠:強骨膠囊(骨碎補總黃酮)為北京岐黃藥業(yè)提供,每克藥中含骨碎補總黃酮含量為0.66 g,每粒藥重2.5 g,使用時加蒸餾水配制成固定的濃度(劑量0.108·kg-1·d-1),用大鼠灌胃針灌胃。
1.3.1 四組大鼠骨痂顯微形態(tài)比較。分別對四組大鼠的脛骨進行采集標本,使用顯微CT對實驗大鼠標本的進行斷層掃描以及三維重建,對實驗大鼠的骨痂形態(tài)進行分析。骨痂的形態(tài)主要包括骨小梁體積、數(shù)量、厚度、分離度、連接密度以及表面積體積比之間的差異。
1.3.2 四組患者的生物力學(xué)指標比較。于骨質(zhì)疏松性骨折造模術(shù)后6周,每組各取5只大鼠,麻醉后行X線檢查,檢查后脫頸處死,剃毛,消毒,于原切口瘢痕出取出脛骨,剝離組織,隨機將其浸泡于10%福爾馬林溶液(pH=7.4)中固定72 h,72 h后將標本予磷酸緩沖鹽溶液浸泡沖洗15 min,重復(fù)3次;之后放入裝有75%酒精的標本被中,并置于4 ℃冰箱中保持備用,予同樣方法取對側(cè)整根脛骨,由生理鹽水浸濕后的濕紗布包裹放入- 20 ℃冰箱中備用,復(fù)溫后進行生物力學(xué)測試。對大鼠脛骨進行壓縮試驗,將標本從- 20 ℃取出,復(fù)溫,放置于生物力學(xué)試驗機上進行壓縮試驗,加載速度設(shè)定為2 mm/min,先予加載10N三次,3次完全卸載后再觀察是否歸零。每個標本進行3次。最后給予加載100N一次,觀察最大載荷,記錄結(jié)構(gòu)最大載荷、結(jié)構(gòu)能量吸收、材料最大應(yīng)力、材料能量吸收。
1.3.3 四組大鼠的組織形態(tài)學(xué)比較。用于病理組織學(xué)檢查的手術(shù)側(cè)脛骨標本,經(jīng)脫鈣6周后,將標本脫水處理,脫水后予石蠟包埋制成蠟塊標本,轉(zhuǎn)輪式切片以厚度為4 μm為準,連續(xù)切片,30 ℃烤片過夜,備用。取切片后的骨組織,行HE染色,于顯微鏡下比較切片內(nèi)骨架面積(mm2)及軟骨或骨性骨痂面積比。
采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,所有計量資料采用獨立樣本t檢驗進行對比。兩兩比較,采用LSD-t檢驗,計量資料以[n(%)],P<0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
四組大鼠的骨小梁體積、數(shù)量、厚度、分離度、連接密度以及表面積體積比之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),經(jīng)過兩兩比較,聯(lián)合用藥組患者的骨小梁體積、數(shù)量、厚度、連接密度高于單獨用藥組,分離度、表面積體積比低于對照組(P<0.05)。見表1。
表1 四組大鼠骨痂顯微形態(tài)比較 n=20
四組大鼠的結(jié)構(gòu)最大載荷、結(jié)構(gòu)能量吸收、材料最大應(yīng)力、材料能量吸收之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義,聯(lián)合用藥組患者的最大載荷、結(jié)構(gòu)能量吸收、材料最大應(yīng)力、材料能量吸收高于單獨用藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
表2 四組患者的生物力學(xué)指標比較 n=20
四組患者的骨架面積及軟骨或骨性骨痂面積比之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),經(jīng)過兩兩比較,聯(lián)合用藥組患者的骨架面積及軟骨或骨性骨痂面積比高于單獨用藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。
表3 四組大鼠的組織形態(tài)學(xué)比較 n=20
圖1 A為對照組,B為聯(lián)合治療組
隨著年齡的增長,患者的骨質(zhì)疏松發(fā)病率顯著升高,有研究認為[6],隨著患者骨組織的不斷衰老,其鈣鹽以及基質(zhì)的比例顯著發(fā)生變化,骨質(zhì)疏松患者多見于絕經(jīng)后的女性以及老年男性。在骨質(zhì)疏松骨折患者中,多見于退行性骨質(zhì)疏松,患者表現(xiàn)為顯著的身長縮短以及駝背[7]。在對骨質(zhì)疏松患者的血清學(xué)指標的分析中,其血清鈣、磷含量通常處于正常水平,骨折患者在痊愈后可表現(xiàn)為堿性磷酸酶水平的異常增高[8]。富含血小板的血漿可通過對患者的多種細胞因子的釋放,改善患者的細胞愈合、增殖,對于患者的骨折部位的愈合具有積極的意義。強骨膠囊的主要成分為骨碎補總黃酮,該種成分對于患者的骨骼新陳代謝水平具有重要意義[9]。
本研究中采用的動物模型為女性絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松,在對實驗大鼠直視的情況下,對實驗大鼠進行骨折模型的制備。研究認為[10],在實驗大鼠的骨折后,骨折病灶部位的修復(fù)過程中,在軟骨細胞的形成以及成熟過程中,通過軟骨細胞的肥大作用,其基質(zhì)發(fā)生溶解鈣化,同時,新生的血管通過對軟骨內(nèi)組織的浸潤,進一步促進成骨細胞的形成,最終促進患者的骨痂愈合[11]。在此過程中,隨著對實驗大鼠的富含血小板的血漿使用,通過對實驗大鼠多種細胞因子的分泌,促進成骨細胞以及軟骨細胞的增殖,對于患者的骨痂愈合具有重要的意義[12]。而在對實驗大鼠采用強骨膠囊治療,通過對實驗大鼠的骨質(zhì)新陳代謝水平的升高,對于骨折的預(yù)后具有積極的作用[13]。在本研究中,聯(lián)合用藥組患者的骨小梁體積、數(shù)量、厚度、連接密度顯著高于單獨用藥組,分離度、表面積體積比顯著低于對照組;聯(lián)合用藥組患者的最大載荷、結(jié)構(gòu)能量吸收、材料最大應(yīng)力、材料能量吸收顯著高于單獨用藥組;聯(lián)合用藥組患者的骨架面積及軟骨或骨性骨痂面積比顯著高于單獨用藥組,提示,通過聯(lián)合用藥,實驗大鼠的骨質(zhì)密度以及抗壓性顯著提升,同時通過對骨痂面積比例的分析,實驗大鼠的骨痂面積顯著降低,由此造成的局部炎性反應(yīng)水平相對降低[14]。研究認為,在實驗大鼠的病變過程中,由于實驗大鼠處于高度應(yīng)激反應(yīng)過程中,由此造成的實驗大鼠血管內(nèi)皮細胞的損傷,局部炎性因子大量分泌,在一定程度上抑制了骨質(zhì)的愈合[15]。而在實驗大鼠的治療中, 通過采取強骨膠囊以及富含血小板的血漿治療中,通過聯(lián)合治療,共同發(fā)揮協(xié)同作用,治療效果顯著。
綜上所述,富血小板血漿聯(lián)合強骨膠囊通過對骨折部位骨質(zhì)密度以及骨質(zhì)強度的顯著增強,大鼠骨質(zhì)疏松性骨折骨愈合情況良好。