薏苡仁油軟膠囊的急性毒性和亞急性毒性研究

黃樣增

(福建仙芝樓生物科技有限公司 藥用菌栽培與深加工國家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350002)

薏苡仁被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)列為藥食兼用品，具有健脾利濕、除痹止瀉、清熱排膿的功效，可以用于水腫、小便不利、腳氣、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、腸癰、肺癰、扁平疣等的治療。作為一種藥食兩用的功能性食品原料，人們對(duì)薏苡仁的關(guān)注日益增加，開發(fā)薏苡仁類保健產(chǎn)品成為發(fā)展的必然趨勢(shì)。薏苡仁油是從禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobi. var.ma-yuan(Roman.)Stapf)的干燥成熟種仁[1]中提取的活性物質(zhì)。薏苡仁含有2%～7%的薏苡仁油，薏苡仁油富含不飽和脂肪酸，主要成分為油酸[2-3]、亞油酸，具有抗腫瘤[4]、抗白血病[5]、鎮(zhèn)痛止血[6]的作用。薏苡仁油軟膠囊為增強(qiáng)機(jī)體免疫力的保健品[7],但是目前對(duì)于薏苡仁油軟膠囊的安全性報(bào)道較少。為科學(xué)評(píng)價(jià)其安全性,本文對(duì)薏苡仁油軟膠囊進(jìn)行了急性毒性和亞急性毒性研究，以期為薏苡仁的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

薏苡仁，購買于福建省浦城縣，按照《中國藥典》(2015年版一部)檢測合格后，經(jīng)超臨界CO2萃取分離，得薏苡仁油(密度為0.87 g/mL)，直接經(jīng)壓丸后得到薏苡仁油軟膠囊。軟膠囊內(nèi)容物組成是純薏苡仁油(99.5%)和0.5%維生素E，其中甘油三酯含量大于等于90%。薏苡仁油軟膠囊內(nèi)容物，成人日推薦劑量為2.0 g，相當(dāng)于0.033 3 g/kg(成人體重以60 kg計(jì))，臨用前分別稱取樣品(薏苡仁油軟膠囊內(nèi)容物)16.66、33.4、66.6 g加大豆油至100 mL，攪拌均勻，作為低、中、高劑量組受試物。

大豆油(非轉(zhuǎn)基因)，購于福州金滿福糧油貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供的清潔級(jí)ICR小鼠20只，體重18～22 g，雌雄各半；清潔級(jí)SD大鼠80只，體重67～85 g，雌雄各半。試驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002。

1.1.3 飼養(yǎng)環(huán)境

福建省疾病預(yù)防控制中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)為SYXK(閩)2012-0008。

1.1.4 儀器與設(shè)備

日立7060C全自動(dòng)生化分析儀，SHANDON EXCELSIOR全自動(dòng)密封脫水機(jī)，美國雅培CELL-DUN3700血球分析儀，LEICA EG 1150石蠟包埋機(jī)，CS-IV攤片烤片機(jī)，SHANDON Finesse325石蠟切片機(jī)，電熱鼓風(fēng)干燥箱，LEICA ST5020全自動(dòng)染片機(jī)，OLYMPUS BX51顯微鏡，電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003版)》，進(jìn)行小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)和大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，分別觀察薏苡仁油軟膠囊的急性毒性和亞急性毒性。

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)若LD50大于或等于100倍者，則可以考慮進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。選取18～22 g健康ICR小鼠20只，雌雄各半。試驗(yàn)前小鼠隔夜禁食16 h，不禁水。取薏苡仁油軟膠囊內(nèi)容物以經(jīng)口方式灌胃，灌胃劑量為17.4 g/(kg·d)。成人日推薦劑量為2.0 g，相當(dāng)于0.033 3 g/(kg·d)(成人體重以60 kg計(jì))。則試驗(yàn)倍數(shù)為17.4/0.033 3≈522，遠(yuǎn)大于100倍。灌胃后，連續(xù)觀察14 d，每天觀察并記錄動(dòng)物中毒的表現(xiàn)和死亡情況。室內(nèi)保持溫度18～22℃，相對(duì)濕度50%～60%，噪聲60 dB以下，照明10～14 h，換氣8～20次/h；每3 d洗1次飲水瓶，每天下午加滿全價(jià)營養(yǎng)塊狀飼料和飲水。

1.2.2 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

1.2.2.1 分組及給予受試物

按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003版)》的要求，若30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)未觀察到有害作用的最大劑量大于或等于人的可能攝入量的100倍，綜合其他各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可初步做出安全性評(píng)價(jià)。將雌雄大鼠按體重隨機(jī)分成4組，每組各10只。試驗(yàn)按受試物成人日推薦量的25、50、100倍，設(shè)3個(gè)劑量組分別為0.833、1.67、3.33 g/(kg·d)，另設(shè)大豆油為對(duì)照組。按5 mL/(kg·d)經(jīng)口灌胃給予不同濃度受試物及對(duì)照物1次。試驗(yàn)期間動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每天觀察動(dòng)物形態(tài)，記錄飼料灑漏量，每周記錄1次體重和2次食物攝入量。喂養(yǎng)30 d禁食過夜后稱重，采血做血常規(guī)及生化指標(biāo)測定，取出脾、肝、睪丸、腎稱重，并對(duì)胃腸、脾、肝、腎、睪丸、卵巢做病理學(xué)檢查。室內(nèi)保持溫度18～22℃，相對(duì)濕度50%～60%，噪聲60 dB以下，照明10～14 h，換氣8～20次/h；每3 d洗1次飲水瓶，每天下午加滿全價(jià)營養(yǎng)塊狀飼料和飲水。

1.2.2.2 觀察指標(biāo)

(1)動(dòng)物的一般表現(xiàn)、體重、進(jìn)食量、食物利用率。

(2)血常規(guī)及生化指標(biāo)：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類、血紅蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素、甘油三酯、總膽固醇、血糖、總蛋白、白蛋白。

(3)病理解剖：臟體比、大體觀察及病理組織學(xué)檢查(胃腸、肝、脾、腎、睪丸和卵巢)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差不齊的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Tambane法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)(見表1)

由表1可知，試驗(yàn)期間動(dòng)物未見異常；受試物屬無毒級(jí)。

表1 薏苡仁油急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

2.2 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.2.1 一般形態(tài)觀察

該樣品3個(gè)劑量組的大鼠毛質(zhì)白、有光澤，外觀形態(tài)與對(duì)照組比較無區(qū)別，也無死亡現(xiàn)象。

2.2.2 動(dòng)物體重增長與食物利用率(見表2～表4)

由表2～表4可見，試驗(yàn)期間，各劑量組每周體重、進(jìn)食量、食物利用率及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各劑量組大鼠體重及體重增量、總進(jìn)食量、總食物利用率與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 薏苡仁油對(duì)大鼠體重的影響

表3 薏苡仁油對(duì)大鼠進(jìn)食量的影響

表4 薏苡仁油對(duì)大鼠食物利用率的影響

2.2.3 血常規(guī)檢查結(jié)果(見表5)

由表5可見，各劑量組大鼠的血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 血常規(guī)檢查結(jié)果

2.2.4 血清生化檢驗(yàn)結(jié)果(見表6)

由表6可見，與對(duì)照組比較，雄性高劑量組大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、雌性低劑量組大鼠血清血糖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但均在本實(shí)驗(yàn)室正常值范圍內(nèi)。其余各劑量組大鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素、肌酐、血糖、總膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表6 血清生化檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 對(duì)大鼠臟體比的影響(見表7)

由表7可見，各劑量組大鼠禁食后體重、臟體比與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表7 薏苡仁油對(duì)大鼠臟體比的影響

續(xù)表7

2.2.6 病理組織學(xué)檢查

(1)各劑量組動(dòng)物大體檢査未發(fā)現(xiàn)明顯病變，且生化指標(biāo)未見異常，因此僅選高劑量組和對(duì)照組做組織病理學(xué)檢查。

(2)結(jié)果描述

肝：正常肝小葉結(jié)構(gòu)存在，個(gè)別肝細(xì)胞輕度變性腫脹。個(gè)別肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)少許細(xì)小的脂肪空泡，呈輕度脂變，這種脂變肝細(xì)胞范圍小，呈散在小灶分布。肝細(xì)胞無壞死改變。個(gè)別肝匯管區(qū)見淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，膽管未見異常，無纖維組織增生。大鼠肝臟病理檢測結(jié)果見表8。

表8 大鼠肝臟病理檢測結(jié)果

腎：腎皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，個(gè)別腎小管輕度腫脹及空泡變性，個(gè)別腎間質(zhì)中有灶性炎癥細(xì)胞浸潤，個(gè)別腎小管內(nèi)可見管型，少數(shù)腎髓質(zhì)部可見小囊腫。大鼠腎臟病理檢測結(jié)果見表9。

表9 大鼠腎臟病理檢測結(jié)果

胃和十二指腸：未見異常，黏膜完整，無明顯出血、糜爛、壞死、潰瘍及炎癥細(xì)胞浸潤，無明顯腺體增生萎縮改變。

脾：未見異常，脾白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清楚，紅髓、白髓無眀顯擴(kuò)張或萎縮現(xiàn)象。

睪丸：未見異常，曲細(xì)精管正常，可見各級(jí)生精細(xì)胞及成熟精子。

卵巢：未見異常，發(fā)育正常，可見各級(jí)卵泡和成熟黃體。

總之，在胃、脾、睪丸、卵巢和十二指腸中未發(fā)現(xiàn)病理學(xué)改變，僅在個(gè)別大鼠的肝臟和腎臟中發(fā)生病理學(xué)改變，各組標(biāo)本病理變化無明顯差異，因此認(rèn)為被檢臟器未見與受試物有關(guān)的病理學(xué)改變。

3 結(jié) 論

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果提示薏苡仁油軟膠囊內(nèi)容物按灌胃劑量17.4 g/(kg·d)灌胃小鼠未產(chǎn)生毒性，表明薏苡仁油的最大耐受量大于17.4 g/(kg·d)(相當(dāng)于成人日推薦量的522倍)，根據(jù)急性毒性分級(jí)屬無毒級(jí)。

薏苡仁油軟膠囊內(nèi)容物各劑量組給予大鼠喂養(yǎng)30 d，試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物生長活動(dòng)正常，各劑量組每周體重、進(jìn)食量、食物利用率及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各劑量組大鼠體重、體重增量、總進(jìn)食量、總食物利用率、臟體比與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雄性高劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶、雌性低劑量組血糖與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但均在本實(shí)驗(yàn)室正常值范圍內(nèi)。其余各劑量組大鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素、血糖、甘油三酯、總膽固醇、白蛋白、總蛋白、血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，對(duì)受檢臟器做組織病理學(xué)檢查，未見特異性病變。因此，可以認(rèn)為薏苡仁油軟膠囊內(nèi)容物30 d喂養(yǎng)大鼠，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，即薏苡仁油軟膠囊無亞急性毒性。